【正文】 8)填好的消毒記錄應(yīng)及時(shí)上報(bào)。按此方法進(jìn)行的試驗(yàn)，只是對消毒劑的殺菌能力的重要方面進(jìn)行驗(yàn)證，側(cè)重反映消毒劑的實(shí)用劑量與殺菌能力。 菌懸液與菌片的制備 適用范圍 制備消毒劑殺菌試驗(yàn)用細(xì)菌懸液與菌片，以供消毒劑殺菌試驗(yàn)時(shí)使用。在上述規(guī)定的菌株基礎(chǔ)上，根據(jù)消毒劑特定用途或試驗(yàn)特 殊需要，還可增選其他菌株。 （ 3）磷酸鹽緩沖液 ： 見附錄 A。 （ 5） 稀釋液：見附錄 A。 （ 7）革蘭染色液 ： 見附錄 A。 （ 9）恒溫水浴箱。 （ 11）刻度吸管（ 、 、 ），毛細(xì)吸管。 （ 13）離心機(jī)。 細(xì)菌懸液制備程序 （ 1）細(xì)菌繁殖體懸液的制備 1）取凍干菌種管，在無菌操作下打開，以毛細(xì)吸管加入適量營養(yǎng)肉湯，輕柔吹吸數(shù)次，使菌種融化分散。用接種環(huán)取第 1代培養(yǎng)的菌懸液，劃線接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，于 37℃ 培養(yǎng) 18h～ 24h。 — 17— 2） 取菌種第 3代～ 14代的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面新鮮培養(yǎng)物（ 18h～ 24h），用 吸取 ml～ ， 反復(fù)吹吸，洗下菌苔。 3）初步制成的菌懸液，先用細(xì)菌濃度比濁測定法粗測其含菌濃度，然后以稀釋液稀釋至所需使用的濃度。 應(yīng)當(dāng)天使用不得過夜。 （ 2）細(xì)菌芽孢懸液的制備 1）取凍干菌種管，在無菌操作下打開，以毛細(xì)吸管吸加適量營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，輕柔吹吸數(shù)次，使菌種融化分散。用接種環(huán)取第 1代培養(yǎng)的菌懸液，劃線接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，于 37℃培養(yǎng) 18h～ 24h。 2）用 吸管吸取 ml～ 第 3代～ 5代的 18h～ 24h 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物，接種于羅氏瓶中營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基表面，將其搖動(dòng)使菌液布滿營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的表面，再將多余肉湯培養(yǎng)物吸出， 將羅氏瓶 置于 37℃溫箱內(nèi)，培養(yǎng) 5d～ 7d。 當(dāng)芽孢形成率達(dá) 95% 以上 時(shí) ， 即 可進(jìn)行以下處理。 改良芽孢染色法：①用接種環(huán)取菌樣涂 布于玻片上，待自然干燥。②將涂片放入平皿內(nèi)，片上放兩層濾紙，滴加足量的 % 孔雀綠水溶液。取出，去濾紙，用自來水沖洗殘留孔雀綠溶液。水洗，待干后鏡檢。 4）羅氏瓶培養(yǎng)物，用 吸管加 無菌蒸餾水于每一羅氏瓶中，以 L棒輕輕推刮下菌苔。將第一和第二批洗下的菌懸液 集中于一含玻璃珠的無菌三角燒瓶中，振搖 5min，打碎菌塊，使成均勻的芽孢懸液。 6）用無菌棉花或紗布過濾芽孢懸液，清除其中的瓊脂凝塊。棄上清液，加蒸餾水吹吸使芽孢重新懸浮。 8）將洗凈的芽孢懸浮于三角燒瓶內(nèi)蒸餾水中，并加入適量小玻璃珠。待冷至室溫后，保存于 4℃ 冰箱中備用。 10）芽孢懸液在使用時(shí)，應(yīng)先進(jìn)行活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。 菌片的制備程序 （ 1）消毒試驗(yàn)中使用的菌片是以菌液滴加于載體上制成。根據(jù)其特點(diǎn)選擇適宜材料載體作為代表。 當(dāng)以金屬片為載體時(shí)，因方形金屬載體在振敲時(shí)可將玻璃試 — 18— 管撞碎，故改用 12mm 直徑圓形金屬片（厚 ）。脫脂方法如下： ① 將載體放在含 洗滌劑 的水中煮沸 30 min； ② 以自來水洗凈； ③ 用蒸餾水煮沸 10min； ④ 用蒸餾水漂洗至 pH 呈中性； ⑤ 晾干 、 熨平備用。在剪開前，先將脫脂的布塊按載體規(guī)定的大小，抽去邊緣一周的經(jīng)緯紗各一根，再按抽紗痕剪開。金屬片以不銹鋼制作，紙片以新華濾紙制作。 染菌用菌懸液：使用 TSB營養(yǎng)肉 湯配制。含菌量約為 1108cfu/ml～ 5108cfu/ml，可使用濁度計(jì)調(diào)整菌液濃度。菌液滴加量每片為 10μl。滴染菌液后，染菌載體可置 37℃ 溫箱內(nèi)干 燥 （約 20min～ 30min），或置室溫下自然陰干后再使用。 注意事項(xiàng) （ 1）用濁度計(jì)測定的菌懸液濃度，只用于在滴染菌片時(shí)對菌懸液稀釋度的估計(jì)。 （ 2）滴染時(shí)，菌液滴加量不宜過多，避免流散影響染菌的準(zhǔn)確性。此時(shí)，應(yīng)提高初始菌濃度，以便達(dá)到所需的菌量 。 （ 5）用帶橡皮塞的容器保存菌液時(shí)，應(yīng)將其預(yù)先煮沸 10min 進(jìn)行脫硫處理。 活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)技術(shù) 適用范圍 測定細(xì)菌懸液、菌片、采樣液等樣本中含有活菌的數(shù)量。 （ 2） 稀釋液 ：見附錄 A。 （ 4）電 動(dòng)混合器 操作程序 本規(guī)范要求在殺菌試驗(yàn)中的活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)統(tǒng)一使用傾注法。 （ 1）對菌懸液可直接進(jìn)行培養(yǎng)計(jì)數(shù)。洗菌時(shí)，一般以稀釋液為洗液。而后，用電動(dòng)混合器混合 20s（或在手掌上用力振敲 80 次），將菌洗下形成菌懸液。 — 19— （ 2）將試管按需要數(shù)量 分組排列于試管架上， 每管加入 稀釋液。 （ 3）將菌懸液樣本在用電動(dòng)混合器混合 20s（或在手掌上用力振敲 80次），隨即吸取 加至 101 管內(nèi)。如此類推，直至最后一管。 （ 5）選擇適宜稀釋度試管（以預(yù)計(jì)生長菌落數(shù)每平板為 15cfu～ 300cfu 者為宜），吸取其中混合均勻的懸液 加于無菌平皿內(nèi)。一般需接種 2個(gè)～ 3個(gè)不同稀釋度。 （ 6） 將冷 至 40℃ ～ 45℃ 的熔化營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，傾 注于已加入樣液的平皿中，每平皿15ml～ 20ml。待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，使底向上，置 37℃ 溫箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)至規(guī)定時(shí)間（細(xì)菌繁殖體為 48h，白色念珠菌與細(xì)菌芽孢為 72h），計(jì)數(shù)最終結(jié)果的菌落數(shù)。 （ 10）計(jì)數(shù)菌落時(shí)，一般以肉眼觀察，必要時(shí)用放大鏡檢查。 但對黑曲霉菌活菌計(jì)數(shù)及殺滅試驗(yàn)時(shí)，平板菌落數(shù)應(yīng)在 15cfu～ 100cfu之間。 將求得的平均菌落值，再乘以稀釋倍數(shù)，即得每毫升原樣液中的菌量。 活菌計(jì)數(shù)中技術(shù)操作誤差的測定 試驗(yàn)者在活菌計(jì)數(shù)中因技術(shù)操作而引起的菌落數(shù)誤差率（平板間、稀釋度間）不宜超過10%。 （ 1）平板間誤差率計(jì)算公式 ： %100?? 平板間菌落平均數(shù)平板間菌落數(shù)平均差平板間誤差率 平板數(shù) 的絕對值之和各平板菌落數(shù)平板間菌落平均數(shù)平板間菌落數(shù)平均差 )( ?? 平板數(shù)各平板菌落數(shù)之和平板間菌落平均數(shù) ? （ 2）稀釋度間誤差率計(jì)算公式 ： %100?? 稀釋度間菌落平均數(shù)稀釋度間菌落數(shù)平均差稀釋度間菌落數(shù)誤差率 稀釋度數(shù) 的絕對值之和各稀釋度菌落數(shù)稀釋度間菌落平均數(shù)稀釋度間菌落平均差 )(= 稀釋度數(shù) 和各稀釋度平均菌落數(shù)之稀釋度間菌落平均數(shù) = — 20— 注意事項(xiàng) （ 1）嚴(yán)格無菌操作，防止污染。 （ 3）注意菌液的均勻分散。 （ 5）每吸取一個(gè)稀釋度樣液，必須更換一支吸管，以減少誤差。 （ 7）傾注時(shí)瓊脂培養(yǎng)基溫度不得超過 45℃ ，以防損傷細(xì)菌或真菌。勿使培養(yǎng)基外溢，以免影響結(jié)果的準(zhǔn)確性和造成環(huán)境的污染。 （ 9）結(jié)果計(jì)算時(shí)，必須弄清稀釋倍數(shù)，以免計(jì)算錯(cuò)誤。因?yàn)橄倔w系中殘留的消毒劑，可能對微生物的生長繁殖具有一定抑制作用，從而可導(dǎo)致對殺菌效果偏高的錯(cuò)誤判斷，甚至產(chǎn)生假陰性結(jié)果。 除藥的原則 （ 1）可有效去除殘留的消毒劑。 （ 3）不破壞培養(yǎng)基的營養(yǎng)成份，不影響其透明度。 除藥的方法 （ 1）化學(xué)中和法：又稱中和劑法，是指在消毒劑與微生物作用到達(dá)規(guī)定時(shí)間的終點(diǎn)時(shí)，取樣加于適宜種類和濃度的中和劑中，將殘留消毒劑迅速中和，使其不再持續(xù)抑制或殺滅微生物的方法。 對常用消毒劑，雖有一些中和劑介紹，但在實(shí)際應(yīng)用中由于情況多變，效果不一定都理想。 操作要點(diǎn)： ① 對接觸消毒劑的微生物樣本，在達(dá) 到規(guī)定作用時(shí)間，即刻取樣移入鑒定合格的中和劑溶液中； ② 所用中和劑的濃度與容量應(yīng)與鑒定試驗(yàn)結(jié)果規(guī)定的相同； ③ 即刻混勻，并按規(guī)定時(shí)間吸取樣液進(jìn)行隨后的培養(yǎng)檢測； ④ 在將樣本接種培 養(yǎng)基以前的操作，應(yīng)按規(guī)定時(shí)間內(nèi)進(jìn)行，以免微生物與中和劑或中和產(chǎn)物接觸過久。多用于難以找到適宜中和劑的消毒 — 21— 劑試驗(yàn)中 ，如以植物提取物制備的消毒劑。 操作要點(diǎn)： ① 準(zhǔn)備好裝有相應(yīng)孔徑微孔濾膜的濾器； ② 濾膜及濾器需先經(jīng)滅菌處理； ③初次過濾后，應(yīng)使用一定量對微生物無害的稀釋液進(jìn)行沖洗，沖洗次數(shù)一般以洗凈消毒劑為準(zhǔn)； ④ 最后一次沖洗、濾凈后，將微孔濾膜以無菌操作法取出，進(jìn)行隨后的培養(yǎng)檢測。但若稀釋過多，微生物濃度下降，可出現(xiàn)假陰性結(jié)果。單獨(dú)使用時(shí)，一般多用于濃度系數(shù)較高的消毒劑（如醇類消毒劑）。 操作要點(diǎn)： ① 對接觸消毒劑的微生物樣本，在達(dá)到規(guī)定作用時(shí)間后，即時(shí)以對微生物無害的稀釋液稀釋，稀釋比例隨試驗(yàn)需要決定； ② 電動(dòng) 混合或敲打振蕩，使之混勻； ③ 吸取稀釋樣 液進(jìn)行隨后培養(yǎng)檢測。 （ 2）每次吸液，均須更換一支無菌吸管，以 防交叉污染。 （ 3）為保證試驗(yàn)的準(zhǔn)確性，所用吸管的容量應(yīng)盡量與擬吸取的液體量相近，不要用大吸管吸取少量液體；試驗(yàn)樣本的混勻操作，必須認(rèn)真進(jìn)行；盡量減少中和劑或中和產(chǎn)物與試驗(yàn)微生物的接觸時(shí)間。故每進(jìn)行一種消毒試驗(yàn)（包括消毒劑或微生物的更換），均需按規(guī)定對所選方法進(jìn)行鑒定試驗(yàn)，合格者方可用于正式試驗(yàn)。 中和劑鑒定試驗(yàn) 目 的 確定所選中和劑是否適用于擬進(jìn)行的細(xì)菌和真菌殺滅試驗(yàn)。 （ 2）刻度吸管（ 、 ）。 （ 4）恒溫水浴箱。 （ 6） 胰蛋白胨大豆 瓊脂培養(yǎng)基 （ TSA）： 見附錄 A。 （ 2）在確定用何種中和劑進(jìn)行鑒定試驗(yàn)有困難時(shí)，可對多個(gè)中和劑進(jìn)行初選以確定（見本 款 文后【附】）。濃度過低，則不足 — 22— 以顯示能否將高濃度消毒 劑 全部中和。 細(xì)菌是否復(fù)蘇。若縮短作用時(shí)間后仍無菌生長，在排除其他原因的基礎(chǔ)上，可適當(dāng)下調(diào)殺菌試驗(yàn)中消毒 劑 濃度，再次進(jìn)行中和劑鑒定試驗(yàn)。對細(xì)菌繁殖體，在大腸桿菌（ 8099）、金黃色葡萄球菌（ ATCC 6538）、銅綠假單胞菌（ ATCC 15442）中任選其一進(jìn)行試驗(yàn)即可；對細(xì)菌芽孢，以枯草桿菌黑色變種（ ATCC 9372）芽孢進(jìn)行。 （ 6）鑒定時(shí)根據(jù)所用殺菌試驗(yàn)方法，使 用相應(yīng)的懸液或載體定量試驗(yàn)。初選操作程序如下： （ 1）將 試驗(yàn)菌懸液（含菌量為 1103 cfu/ml～ 3103 cfu/ml）加入含 中和劑試管中，混勻，作用 30min后，取 ，用 TSA傾注法培養(yǎng)。 （ 3）試驗(yàn)同時(shí)設(shè)陽性對照組。 當(dāng) 3組平板上長出的菌落數(shù)接近，如果以陽性對照組為標(biāo)準(zhǔn)（ X），前兩組長菌數(shù)為（ X177。 試驗(yàn)分組 第 1組 消毒劑 + 菌懸液 → 培養(yǎng) 觀察消毒劑對試驗(yàn)菌有無殺滅或抑制能力。 第 3組 中和劑 + 菌懸液 → 培養(yǎng) 觀察中和劑是否抑菌。 第 5組 稀釋液 + 菌懸液 → 培養(yǎng) 作為菌數(shù)對照。 中和劑懸液定量鑒定試驗(yàn)操作程序 根據(jù)試驗(yàn)分組，準(zhǔn)備足量試管和平皿，依次進(jìn)行編號。 1℃水浴中待用 。取 ，加入 ，制成含有機(jī)干擾物質(zhì)的菌懸液，置 20℃177。 （ 1）第 1 組。1℃ 水浴中 — 23— 5min 后， 再吸加 ，混勻。吸取該最終樣液 ，接種于平皿中，做活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。 吸取 ， 置 20℃ 177。作用至預(yù)定時(shí)間，吸此樣液 加于含 中和劑溶液管中，混勻，作用 10min。 如平板生長菌落數(shù)均超過 300 個(gè)，應(yīng)以 稀釋液 對上述最終樣液作適宜稀釋后，再次進(jìn)行活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。吸取 ， 置 20℃ 177。 加入 ，作用 10min。 （ 4）第 4 組。1℃ 水浴中 5min 后， 吸加 （以 ，作用 10min 配制而成）于試管內(nèi)，混勻。 （ 5）第 5組。1℃ 水浴中 5min 后， 吸加 于試管內(nèi)，混勻。 （ 6）第 6 組。如出現(xiàn)細(xì)菌生長，可能提示試驗(yàn)材料或操作過程中有污染。 中和劑載體定量鑒定試驗(yàn)操作程序 根據(jù)試驗(yàn)分組，準(zhǔn)備足量試管和平皿，依次進(jìn)行編號。 （ 1）第 1組。1 ℃ 水浴中 5min后，用無菌鑷子夾入一菌片，并使浸透于消毒液中。用電動(dòng)混合器混合 20s，或?qū)⒃嚬苷翊?80次，吸取該最終樣液 ，接種于平皿中，做活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。吸取消毒劑 于無菌小平皿內(nèi)，將其置 20℃ 177。作用10min，吸取該最終樣液 ，分別接種于各平皿中，做活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。 （ 3）第 3 組。1 ℃ 水浴中 5min 后，用無菌鑷子夾入 1 菌 片，并使浸透于中和劑內(nèi)，作用 10min。吸取該最終樣液 ，用中和劑做 10 倍系列稀釋，選適宜稀釋度懸液，吸取 ，分別接種于平皿中，做活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。 吸取中和產(chǎn)物溶液 （以 一片 浸有消毒劑的載體置 中和劑內(nèi)，作用 10min） 于無菌小平皿內(nèi)，將其置 20℃ 177。作 用 10min，用無菌鑷子取出菌片，移入含 中和產(chǎn)物溶液的試管中，用電動(dòng)混合器混合 20s，或?qū)⒃嚬苷翊? 80 次，混勻。 （ 5）第 5 組。1℃ 水浴中 5min 后， 用無菌鑷子夾入 1 菌片，并使浸透于稀釋液中。吸取該最終樣液 ，用稀釋液 做 10倍系列稀釋，選適宜稀釋度懸液，吸取 ，分別接種于平皿中，做活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。分別吸取稀釋液與中和劑各 ，倒入上述試驗(yàn)同批次的培養(yǎng)基 15ml～ 20ml，培養(yǎng)觀察。應(yīng)重新進(jìn)行試驗(yàn)。 （ 2） 第 2 組 有較第 1 組為多，但較第 5（ 組 ） 為少的試驗(yàn)菌菌落生長，并符合表 21 要求者。 （ 3） 第 5（ 組 ） 有相似量試驗(yàn)菌生長 ， 懸液試驗(yàn)在 1107 cfu/ml～ 5107 cfu/ml之間 ，載體試驗(yàn) 在 5105 cfu/片～ 5106 cfu/片