【正文】 復(fù) 5 次。 無菌操作的基本要求 （ 1）試驗開始前，應(yīng)以濕式方法清潔臺面和 打掃室內(nèi)地面，然后以紫外線或其他方法對實驗室內(nèi)空氣進(jìn)行消毒； （ 2）實驗人員應(yīng)穿戴工作服、口罩、帽子；進(jìn)行無菌檢驗時 ， 需經(jīng)風(fēng)淋后進(jìn)入實驗室，然后 ， 正確穿戴好無菌隔離衣、帽和口罩； （ 3）每吸取一次不同樣液應(yīng)更換無菌吸管，接種環(huán)（針）需在火焰上燒灼滅菌后，才可再次使用； （ 4）要求無菌的試劑，如蒸餾水、生理鹽水、磷酸鹽緩沖液、培養(yǎng)基、牛血清白蛋白、標(biāo)準(zhǔn)硬水、中和劑等，均需滅菌或過濾除菌； （ 5）無菌器材和試劑，使用前須檢查容器或包裝是否完整，有破損者不得使用； （ 6）正在使用的無菌器材和試劑不得長時間暴露于空 氣中； （ 7）移液或接種時，應(yīng)將試管口和瓊脂平板靠近火焰，防止污染； （ 8）所有用過的污染器材，應(yīng)立即放入盛有消毒液的容器中，以防止對周圍環(huán)境和清潔物品造成污染； （ 9）若不慎發(fā)生微生物培養(yǎng)物摔碎或其他試驗微生物泄漏事故時，不論是否具有致病性，均應(yīng)立即對污染及可能波及的區(qū)域進(jìn)行消毒處理； （ 10）全部試驗結(jié)束后，應(yīng)按常規(guī)對室內(nèi)空氣和環(huán)境表面進(jìn)行消毒處理。又稱作用時間、處理時間。如，設(shè)定 SAL 為106，即經(jīng)滅菌處理后在一百萬件物品中最多只允許有一件物品存在活微生物。 自然菌 natural bacteria 在消毒試驗中 ， 指存在于某一試驗對象上非人工污染的細(xì)菌。 高效消毒劑 highefficacy disinfectant 指可殺滅一切細(xì)菌繁殖體（包括分枝桿菌）、病毒、真菌及其孢子等，對細(xì)菌芽孢（致病性芽孢菌）也有一定殺滅作用，達(dá)到高水平消毒要求的制劑。本規(guī)范含總則、消毒檢驗技術(shù)規(guī)范、醫(yī)療衛(wèi)生機構(gòu)消毒技術(shù)規(guī)范和疫源地消毒技術(shù)規(guī)范四個部分。 生物指示物 biological indicator 將適當(dāng)載體染以一定量的特定微生物 ， 用于指示消毒或滅菌效果的制品。 中和劑 neutralizer 在微生物殺滅試驗中，用以消除試驗微生物與消毒劑的混懸液中和微 生物表面上殘留的消毒劑，使其失去對微生物抑制和殺滅作用的試劑。 殺滅率 killing rate， KR 在微生物殺滅試驗中，用百分率表示微生物數(shù)量減少的值。 無菌檢驗 sterility testing 證明滅菌后的物品中是否存在活微生物所進(jìn)行的試驗。 消毒產(chǎn)品功效檢驗的基本原則和要求 — 4— 消毒產(chǎn)品檢驗的基本要求 消毒實驗室的基本要求 檢驗機構(gòu)的微生物實驗室應(yīng)采取封閉式布局，建筑應(yīng)便于清潔、消毒。 （ 3）化學(xué)指示物、生物指示物、滅菌包裝、衛(wèi)生用品和 1 次性使用醫(yī)療用品，送檢單位應(yīng)送檢 3 批樣品。 試驗設(shè) 3 個不同作用時間，原則上第一時間為說明書規(guī)定的最短作用時間的 倍，第二時間為最短作用時間，第三時間為最短作用 時間的 倍。對用于 滅菌的消毒劑 則以說明書中規(guī)定的使用濃度和其 倍的作用時間驗證其滅菌效果。 （ 2） pH 值的測定：所有消毒劑需測定消毒劑原液的 pH 值，固體消毒劑應(yīng)測定最高應(yīng)用濃度的 pH 值。 不同用途的消毒劑和消毒器械，實驗室殺滅微生物試驗的代表微生物應(yīng)按照 表 11 所列者選擇 。其中醫(yī)療器械的模擬現(xiàn)場試驗應(yīng)區(qū)分消毒或滅菌。其要求與消毒劑的金屬腐蝕性 — 7— 試驗相同。復(fù)方消毒劑以其殺菌主要有效成分含量表示；植物消毒劑以百分濃度表示，如 1 份原液加 4 份水即該消毒劑溶液的濃度為 20%。必要時，還需要經(jīng)過多種試驗，多個實驗室重復(fù)，查閱國內(nèi)外文獻(xiàn) ， 從各個角度證明，才能做出可靠的結(jié)論。各樣品檢測可能有其特 殊 性，因樣品用途、用法不同，其檢驗條件和檢驗方法亦可隨之改變，若檢驗報告中不說明其改變的情況，將會影響對所得結(jié)果做 出準(zhǔn)確的評價。 殺菌劑量包含有兩個參數(shù)，一是殺菌因子的強度，二是作用的時間。 以滴定法分析有效成分時，滴定液用量不宜超過滴定管所標(biāo)示的 量。未經(jīng)濃度標(biāo)定者則稱“溶液”，以示區(qū)別。玻璃儀器清洗干凈，用蒸餾水沖洗 3 遍。 對于本規(guī)范中測定方法不適用的產(chǎn)品，有效 成分的測定，由廠家提供檢測方法及方法可靠性的論證報告，經(jīng)檢驗機構(gòu)認(rèn)可后方可采用。 (2)第二類消毒劑：指國外已批準(zhǔn)生產(chǎn)、現(xiàn)由我國首次生 產(chǎn)或首次進(jìn)口的消毒劑。 (5)手和皮膚消毒劑：除按第一類、第二類或第三類消毒劑的要求進(jìn)行毒理學(xué)試驗外 ， 還必須進(jìn)行完整皮膚刺激試驗。 （ 2）提供受試樣品與毒性有關(guān)的物理、化學(xué)性質(zhì)的資料，以及消毒劑的配方、主要成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)和含量、 pH 值等，但 植物成分組配的消毒劑可不提供化學(xué)結(jié)構(gòu)。 醫(yī)療衛(wèi)生機構(gòu)消毒、滅菌基本要求 消毒因子作用的水平 根據(jù)消毒因子的適當(dāng)劑量（濃度）或強度和作用時間對微生物的殺滅能力，可將其分為四個作用水平的消毒方法。如單鏈季銨鹽類消毒劑 (苯扎溴銨等 )、雙胍類消毒劑如氯己定、植物類消毒劑和汞、銀、銅等金屬離子消毒劑等進(jìn)行消毒的方法。 微生物對消毒因子的敏感性 一般認(rèn)為，微生物對消毒因子的敏感性從高到低的順序為： （ 1）親脂病毒（有脂質(zhì)膜的病毒），例如乙型肝炎病毒、流感病毒等。 （ 2）根據(jù)物品污染后的危害程度選擇消毒、滅菌的方法。 3）對受到一般細(xì)菌和親脂病毒等污染的物品，可選用中水平或低水平消毒法。 消毒、滅菌基本程序 被甲類傳染病病人，以及肝炎、結(jié)核、艾滋病、炭疽病等病人的排泄物、分泌物、血液等污染的器材和物品，應(yīng)先消毒再清洗，于使用前再按物品危險性的種類，選擇合 理的消毒、滅菌方法進(jìn)行消毒或滅菌處理。 疫源地消毒基本要求 組織執(zhí)行與人員 — 13— （ 1）對甲類傳染病和肺炭疽、艾滋病等乙類傳染病必須在當(dāng)?shù)丶膊☆A(yù)防控制和監(jiān)督機構(gòu)的監(jiān)督指導(dǎo)下，由有關(guān)單位和個人及時進(jìn)行消毒處理，或由當(dāng)?shù)丶膊☆A(yù)防控制和監(jiān)督機構(gòu)負(fù)責(zé)進(jìn)行終末消毒。 (1)消毒工具：背負(fù)式噴霧器、氣溶膠噴霧器、機動噴霧器、配藥桶（ 10L）、刻度量杯（筒）、工具箱、消毒車。 3)消毒方法的選擇：以消毒因子的性能、消毒對象、病原體種類為依據(jù)選擇消毒方法?！叭珠_”是指：①分住室（條件不具 — 14— 備可用布簾隔開，至少要分床）；②分飲食；③分生活用具（包括餐具、洗漱用具、便盆、痰罐等）。 4)仔細(xì)了解病員患病前和患病期間居住的房間、活動場所，用過的物品、家具，吐瀉物、污染物傾倒或存放地點，以及污水排放處等，據(jù)此確定消 毒范圍和消毒對象。 11)對室內(nèi)地面、墻壁、家具和陳設(shè)物品消毒時，應(yīng)按照先上后下，先左后右的方法，依次進(jìn)行消毒 。將衣物污染面向內(nèi)卷在一起，放在布袋中帶回消毒。在用化學(xué)法消毒時應(yīng)盡量選擇對相應(yīng)致病微生物殺滅作用良好，對人、畜安全，對物品損害輕微，對環(huán)境影響小的消毒劑。 7)清點所消耗的藥品器材，加以整修、補充。 （ 2）有機干擾物：見附錄 A。 （ 10）玻璃漏斗。挑取上述第 2 代培養(yǎng)物中典型菌落，接種于營養(yǎng)瓊脂斜面，于 37℃ 培養(yǎng) 18h～24h，即為第 3代培養(yǎng)物。取含 5 ml～ 10ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基試管，滴入少許菌種懸液，置 37℃ 培養(yǎng) 18h～ 24h。而后通過火焰加熱將菌固定于玻片上。吸出第一批洗下的菌懸液，再向瓶內(nèi)吸加 無菌蒸餾水，重復(fù)洗菌一遍。 9）將芽孢液放于 80℃ 水浴中 10min（或 60℃ ， 30min），以殺滅殘余的細(xì)菌繁殖體。載體可以為方形，大小為 10mm10mm。 （ 4）載體經(jīng)壓力蒸汽滅菌后，使用滴染法 染菌 。 （ 5）每個菌片的回收菌數(shù)，按活菌培養(yǎng)計數(shù)所得結(jié)果，應(yīng)為 5105 cfu/片～ 5106 cfu/片。 （ 6）制得的菌懸液和菌片，用畢應(yīng)隨時放入冰箱內(nèi)，盡量減少在室溫下放置時間，以 減少 細(xì)菌的自然死亡。對菌片、采樣棉拭與小型固體樣本等，應(yīng)將其上的細(xì)菌洗下成為菌懸液后進(jìn)行培養(yǎng)計數(shù)。 （ 4）將 101 管依前法用電動混合器混合 20s（或在手掌上用力振敲 80次），混勻，再吸取出 102 管內(nèi)。 （ 7）將平皿蓋好，即刻輕輕搖動混勻，平放于臺上。 對估計菌量極少的樣本（如消毒處理后樣本），在培養(yǎng)計數(shù)時可不作稀釋，即使平板菌落數(shù)未達(dá) 15時，亦可用其計算最終結(jié)果。 （ 4）稀釋或取液時要準(zhǔn)確，盡量減少吸管使用中產(chǎn)生的誤差。 殘留消毒劑的去除方法 目 的 在化學(xué)消毒試驗中，達(dá)到規(guī)定消毒時間 終點時，要求立即終止殘留消毒劑的繼續(xù)作用，以便準(zhǔn)確檢測出消毒體系中殘留存活的微生物及其數(shù)量。本法同時含有稀釋作用效果（至少 1:1稀釋，常用 1:10稀釋） ， 是最為普遍使用的方法。 （ 3）稀釋法 將經(jīng)消毒劑作用過的微生物樣本，用稀釋液稀釋，降低殘留消毒劑濃度，以消除對微生物的抑制作用。此點由于操作繁瑣，器材需求量大，往往不能認(rèn)真執(zhí)行，應(yīng)加以注意。 （ 3）小平皿（ 4 cm～ 6cm 直徑）。 （ 4）鑒定試驗中，消毒后去除殘留消毒 劑 組（第 2組）無菌生長，不能表明中和后 受到消毒劑作用后的細(xì)菌是否能恢復(fù)生長。 【附】中和劑初選試驗 中和劑鑒定試驗前，若難確定擬檢測的中和劑，可通過本試驗初選，而后以選中的中和劑進(jìn)行正式的鑒定試驗。 第 2組 （消毒劑 + 菌懸液） + 中和劑 → 培養(yǎng) 觀察殘留消毒劑被 中和后受到清毒劑作用后的試驗菌是否能恢復(fù)生長。 按 。 （ 2）第 2組。1℃ 水浴中 5min 后， 加入 ，混勻。吸取 ， 置 20℃ 177。各組分 別用適宜大小容量的無菌定量吸管按以下程序吸取或添加試劑和試驗樣本。1℃ 水浴中 5min 后，用無菌鑷子夾入一菌 片，并使浸透于消毒液中，待作用至試驗預(yù)定時間，立即用無菌鑷子取出菌片移入含 中和劑試管中，用電動混合器混合 20s，或?qū)⒃嚬苷翊?80 次。 （ 4）第 4 組。作用 10min，立即用無菌鑷子取出菌片移入含 稀釋液的試管中，用電動混合器混合 20s， 或?qū)⒃嚬苷翊? 80 次，混勻。 表 21 中和劑鑒定試驗合格標(biāo)準(zhǔn)中對第 1 組與第 2 組菌落數(shù)的要求 第 1 組平板平均菌落數(shù) 第 2 組平板平均菌落數(shù) 0 5 X（ 1～ 10） （ X + 5） Y（ 10） （ Y + Y） 注：對抑菌作用不明顯消毒劑（如乙醇）所用中和劑的鑒定試驗中，當(dāng)?shù)? 1 組與第 2 組菌落數(shù)相近，難以達(dá)到本表要求時，可根據(jù)具體情況另行作出判斷和評價。 （ 6）第 6 組。1℃ 水浴中 5min 后，用無菌鑷子夾入 1 菌片，并使浸透于中和產(chǎn)物溶液中。 如平板生長菌落數(shù)均超過 300個， 應(yīng)重新吸取該最終樣液 ，用稀釋液做適當(dāng)稀釋，選適宜稀釋度懸液，吸取 ，分別接種于平皿中，做活菌培養(yǎng)計數(shù)。吸取消毒劑 ，將其置 20℃ 177。 加入 ， 作用 10min ，用 稀釋液 做 10倍系列稀釋，選適宜稀釋度懸液，各吸取 ，分別接種于平皿中，做活菌培養(yǎng)計數(shù)。用中和劑 做 10倍系列稀釋 ，選適宜稀釋度懸液，各吸取 ，分別接種于平皿中，做活菌培養(yǎng)計數(shù)。1℃ 水浴中 5min 后， 再吸加 ，混勻。 1℃水浴中備用。 第 4組 （消毒劑 + 中和劑） + 菌液 → 培養(yǎng) 觀察中和產(chǎn)物，或未被完全中和的殘留消毒劑對試驗菌的生長繁殖是否有影響。 （ 2）將 試驗菌懸液（含菌量為 1103 cfu/ml～ 3103 cfu/ml）加入含 物試管中，混勻，作用 30min后，取 ，用 TSA傾注法培養(yǎng)。此時可適當(dāng)縮短作用時間 重新進(jìn)行試驗 ，但作用時間最短不得少于 30s，否則難以控制試 驗的準(zhǔn)確性。 （ 5） 稀釋液 ：見附錄 A。 （ 4）所用方法適宜與否，和消毒劑性質(zhì)、復(fù)方中的附加成份、試驗微生物種類、消毒試驗種類等等均有關(guān)系，試驗條件稍有改變就可能影響除藥效果。本法可單獨使用，但更常見的是與其它方法同 時使用。所以，在消毒試驗前仍應(yīng)將擬用中和劑按試驗具體情況，經(jīng)鑒定合格后再使用。殘留消毒劑的去除（下簡稱除藥），可排除殘留消毒劑對微生物的抑制，從而使試驗獲得正確結(jié)果。 （ 6）樣液接種于平皿后應(yīng)盡快傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，避免樣液干燥于平皿上，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。菌量單位為 cfu。 （ 8）每日觀察細(xì)菌生長情況。必要時，還可作某稀釋度的 1:1或 1:4稀釋。具體方法如下 : 取含 稀釋液無菌試管，對菌片或小型固體樣本直接投入即可，對棉拭則將其采樣端剪入管內(nèi)，每管一份樣本。 試驗器材 （ 1）刻度吸管（ 、 ）。作為菌懸液含菌濃度或菌片染菌量的正式報告（如殺菌試驗中陽性對照組菌懸液或菌片所含菌量），必須以活菌培養(yǎng)計數(shù)的實測結(jié)果為準(zhǔn)，不得使用根據(jù)比濁法判定的估計值。細(xì)菌繁殖體，可直接使用經(jīng) 18h～ 24h培養(yǎng)的斜面培養(yǎng)物，細(xì)菌芽孢可使用 4℃ 冰箱貯存液。 （ 2）所用載體（除濾紙片外）于染菌前，應(yīng)進(jìn)行脫脂處理。 有效使用期為半年。 5）必要時，將盛裝菌懸液的三角燒瓶置 45℃ 水浴中 24h，使菌自溶斷鏈，分散成單個芽孢。將平皿蓋好，放 54℃ ～ 56℃ 條件下，加熱 30min。挑取上述第 2 代培養(yǎng)物中典型菌落，接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，于 37℃ 培養(yǎng) 18h～ 24h，即為第 3 代培養(yǎng)物。隨后，用 移至另一無菌試管中，用電動混合器混合 （振蕩） 20s，或在手掌上振敲 80次，以使細(xì)菌懸浮均勻。 （ 12）數(shù)字可調(diào)移液器（ 10μl，