【正文】 復(fù) 5 次。 無(wú)菌操作的基本要求 （ 1）試驗(yàn)開(kāi)始前，應(yīng)以濕式方法清潔臺(tái)面和 打掃室內(nèi)地面，然后以紫外線或其他方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)空氣進(jìn)行消毒； （ 2）實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)穿戴工作服、口罩、帽子；進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)時(shí) ， 需經(jīng)風(fēng)淋后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室，然后 ， 正確穿戴好無(wú)菌隔離衣、帽和口罩； （ 3）每吸取一次不同樣液應(yīng)更換無(wú)菌吸管，接種環(huán)（針）需在火焰上燒灼滅菌后，才可再次使用； （ 4）要求無(wú)菌的試劑，如蒸餾水、生理鹽水、磷酸鹽緩沖液、培養(yǎng)基、牛血清白蛋白、標(biāo)準(zhǔn)硬水、中和劑等，均需滅菌或過(guò)濾除菌； （ 5）無(wú)菌器材和試劑，使用前須檢查容器或包裝是否完整，有破損者不得使用； （ 6）正在使用的無(wú)菌器材和試劑不得長(zhǎng)時(shí)間暴露于空 氣中； （ 7）移液或接種時(shí)，應(yīng)將試管口和瓊脂平板靠近火焰，防止污染； （ 8）所有用過(guò)的污染器材，應(yīng)立即放入盛有消毒液的容器中，以防止對(duì)周圍環(huán)境和清潔物品造成污染； （ 9）若不慎發(fā)生微生物培養(yǎng)物摔碎或其他試驗(yàn)微生物泄漏事故時(shí)，不論是否具有致病性，均應(yīng)立即對(duì)污染及可能波及的區(qū)域進(jìn)行消毒處理； （ 10）全部試驗(yàn)結(jié)束后，應(yīng)按常規(guī)對(duì)室內(nèi)空氣和環(huán)境表面進(jìn)行消毒處理。又稱作用時(shí)間、處理時(shí)間。如，設(shè)定 SAL 為106，即經(jīng)滅菌處理后在一百萬(wàn)件物品中最多只允許有一件物品存在活微生物。 自然菌 natural bacteria 在消毒試驗(yàn)中 ， 指存在于某一試驗(yàn)對(duì)象上非人工污染的細(xì)菌。 高效消毒劑 highefficacy disinfectant 指可殺滅一切細(xì)菌繁殖體（包括分枝桿菌）、病毒、真菌及其孢子等，對(duì)細(xì)菌芽孢（致病性芽孢菌）也有一定殺滅作用，達(dá)到高水平消毒要求的制劑。本規(guī)范含總則、消毒檢驗(yàn)技術(shù)規(guī)范、醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)消毒技術(shù)規(guī)范和疫源地消毒技術(shù)規(guī)范四個(gè)部分。 生物指示物 biological indicator 將適當(dāng)載體染以一定量的特定微生物 ， 用于指示消毒或滅菌效果的制品。 中和劑 neutralizer 在微生物殺滅試驗(yàn)中，用以消除試驗(yàn)微生物與消毒劑的混懸液中和微 生物表面上殘留的消毒劑，使其失去對(duì)微生物抑制和殺滅作用的試劑。 殺滅率 killing rate， KR 在微生物殺滅試驗(yàn)中，用百分率表示微生物數(shù)量減少的值。 無(wú)菌檢驗(yàn) sterility testing 證明滅菌后的物品中是否存在活微生物所進(jìn)行的試驗(yàn)。 消毒產(chǎn)品功效檢驗(yàn)的基本原則和要求 — 4— 消毒產(chǎn)品檢驗(yàn)的基本要求 消毒實(shí)驗(yàn)室的基本要求 檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)的微生物實(shí)驗(yàn)室應(yīng)采取封閉式布局，建筑應(yīng)便于清潔、消毒。 （ 3）化學(xué)指示物、生物指示物、滅菌包裝、衛(wèi)生用品和 1 次性使用醫(yī)療用品，送檢單位應(yīng)送檢 3 批樣品。 試驗(yàn)設(shè) 3 個(gè)不同作用時(shí)間，原則上第一時(shí)間為說(shuō)明書(shū)規(guī)定的最短作用時(shí)間的 倍，第二時(shí)間為最短作用時(shí)間，第三時(shí)間為最短作用 時(shí)間的 倍。對(duì)用于 滅菌的消毒劑 則以說(shuō)明書(shū)中規(guī)定的使用濃度和其 倍的作用時(shí)間驗(yàn)證其滅菌效果。 （ 2） pH 值的測(cè)定：所有消毒劑需測(cè)定消毒劑原液的 pH 值，固體消毒劑應(yīng)測(cè)定最高應(yīng)用濃度的 pH 值。 不同用途的消毒劑和消毒器械，實(shí)驗(yàn)室殺滅微生物試驗(yàn)的代表微生物應(yīng)按照 表 11 所列者選擇 。其中醫(yī)療器械的模擬現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)應(yīng)區(qū)分消毒或滅菌。其要求與消毒劑的金屬腐蝕性 — 7— 試驗(yàn)相同。復(fù)方消毒劑以其殺菌主要有效成分含量表示；植物消毒劑以百分濃度表示，如 1 份原液加 4 份水即該消毒劑溶液的濃度為 20%。必要時(shí)，還需要經(jīng)過(guò)多種試驗(yàn)，多個(gè)實(shí)驗(yàn)室重復(fù)，查閱國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn) ， 從各個(gè)角度證明，才能做出可靠的結(jié)論。各樣品檢測(cè)可能有其特 殊 性，因樣品用途、用法不同，其檢驗(yàn)條件和檢驗(yàn)方法亦可隨之改變，若檢驗(yàn)報(bào)告中不說(shuō)明其改變的情況，將會(huì)影響對(duì)所得結(jié)果做 出準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)。 殺菌劑量包含有兩個(gè)參數(shù)，一是殺菌因子的強(qiáng)度，二是作用的時(shí)間。 以滴定法分析有效成分時(shí)，滴定液用量不宜超過(guò)滴定管所標(biāo)示的 量。未經(jīng)濃度標(biāo)定者則稱“溶液”，以示區(qū)別。玻璃儀器清洗干凈，用蒸餾水沖洗 3 遍。 對(duì)于本規(guī)范中測(cè)定方法不適用的產(chǎn)品，有效 成分的測(cè)定，由廠家提供檢測(cè)方法及方法可靠性的論證報(bào)告，經(jīng)檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)認(rèn)可后方可采用。 (2)第二類消毒劑：指國(guó)外已批準(zhǔn)生產(chǎn)、現(xiàn)由我國(guó)首次生 產(chǎn)或首次進(jìn)口的消毒劑。 (5)手和皮膚消毒劑：除按第一類、第二類或第三類消毒劑的要求進(jìn)行毒理學(xué)試驗(yàn)外 ， 還必須進(jìn)行完整皮膚刺激試驗(yàn)。 （ 2）提供受試樣品與毒性有關(guān)的物理、化學(xué)性質(zhì)的資料，以及消毒劑的配方、主要成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)和含量、 pH 值等，但 植物成分組配的消毒劑可不提供化學(xué)結(jié)構(gòu)。 醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)消毒、滅菌基本要求 消毒因子作用的水平 根據(jù)消毒因子的適當(dāng)劑量（濃度）或強(qiáng)度和作用時(shí)間對(duì)微生物的殺滅能力，可將其分為四個(gè)作用水平的消毒方法。如單鏈季銨鹽類消毒劑 (苯扎溴銨等 )、雙胍類消毒劑如氯己定、植物類消毒劑和汞、銀、銅等金屬離子消毒劑等進(jìn)行消毒的方法。 微生物對(duì)消毒因子的敏感性 一般認(rèn)為，微生物對(duì)消毒因子的敏感性從高到低的順序?yàn)椋? （ 1）親脂病毒（有脂質(zhì)膜的病毒），例如乙型肝炎病毒、流感病毒等。 （ 2）根據(jù)物品污染后的危害程度選擇消毒、滅菌的方法。 3）對(duì)受到一般細(xì)菌和親脂病毒等污染的物品，可選用中水平或低水平消毒法。 消毒、滅菌基本程序 被甲類傳染病病人，以及肝炎、結(jié)核、艾滋病、炭疽病等病人的排泄物、分泌物、血液等污染的器材和物品，應(yīng)先消毒再清洗，于使用前再按物品危險(xiǎn)性的種類，選擇合 理的消毒、滅菌方法進(jìn)行消毒或滅菌處理。 疫源地消毒基本要求 組織執(zhí)行與人員 — 13— （ 1）對(duì)甲類傳染病和肺炭疽、艾滋病等乙類傳染病必須在當(dāng)?shù)丶膊☆A(yù)防控制和監(jiān)督機(jī)構(gòu)的監(jiān)督指導(dǎo)下，由有關(guān)單位和個(gè)人及時(shí)進(jìn)行消毒處理，或由當(dāng)?shù)丶膊☆A(yù)防控制和監(jiān)督機(jī)構(gòu)負(fù)責(zé)進(jìn)行終末消毒。 (1)消毒工具：背負(fù)式噴霧器、氣溶膠噴霧器、機(jī)動(dòng)噴霧器、配藥桶（ 10L）、刻度量杯（筒）、工具箱、消毒車。 3)消毒方法的選擇：以消毒因子的性能、消毒對(duì)象、病原體種類為依據(jù)選擇消毒方法?！叭珠_(kāi)”是指：①分住室（條件不具 — 14— 備可用布簾隔開(kāi)，至少要分床）；②分飲食；③分生活用具（包括餐具、洗漱用具、便盆、痰罐等）。 4)仔細(xì)了解病員患病前和患病期間居住的房間、活動(dòng)場(chǎng)所，用過(guò)的物品、家具，吐瀉物、污染物傾倒或存放地點(diǎn)，以及污水排放處等，據(jù)此確定消 毒范圍和消毒對(duì)象。 11)對(duì)室內(nèi)地面、墻壁、家具和陳設(shè)物品消毒時(shí)，應(yīng)按照先上后下，先左后右的方法，依次進(jìn)行消毒 。將衣物污染面向內(nèi)卷在一起，放在布袋中帶回消毒。在用化學(xué)法消毒時(shí)應(yīng)盡量選擇對(duì)相應(yīng)致病微生物殺滅作用良好，對(duì)人、畜安全，對(duì)物品損害輕微，對(duì)環(huán)境影響小的消毒劑。 7)清點(diǎn)所消耗的藥品器材，加以整修、補(bǔ)充。 （ 2）有機(jī)干擾物：見(jiàn)附錄 A。 （ 10）玻璃漏斗。挑取上述第 2 代培養(yǎng)物中典型菌落，接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面，于 37℃ 培養(yǎng) 18h～24h，即為第 3代培養(yǎng)物。取含 5 ml～ 10ml營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基試管，滴入少許菌種懸液，置 37℃ 培養(yǎng) 18h～ 24h。而后通過(guò)火焰加熱將菌固定于玻片上。吸出第一批洗下的菌懸液，再向瓶?jī)?nèi)吸加 無(wú)菌蒸餾水，重復(fù)洗菌一遍。 9）將芽孢液放于 80℃ 水浴中 10min（或 60℃ ， 30min），以殺滅殘余的細(xì)菌繁殖體。載體可以為方形，大小為 10mm10mm。 （ 4）載體經(jīng)壓力蒸汽滅菌后，使用滴染法 染菌 。 （ 5）每個(gè)菌片的回收菌數(shù)，按活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)所得結(jié)果，應(yīng)為 5105 cfu/片～ 5106 cfu/片。 （ 6）制得的菌懸液和菌片，用畢應(yīng)隨時(shí)放入冰箱內(nèi)，盡量減少在室溫下放置時(shí)間，以 減少 細(xì)菌的自然死亡。對(duì)菌片、采樣棉拭與小型固體樣本等，應(yīng)將其上的細(xì)菌洗下成為菌懸液后進(jìn)行培養(yǎng)計(jì)數(shù)。 （ 4）將 101 管依前法用電動(dòng)混合器混合 20s（或在手掌上用力振敲 80次），混勻，再吸取出 102 管內(nèi)。 （ 7）將平皿蓋好，即刻輕輕搖動(dòng)混勻，平放于臺(tái)上。 對(duì)估計(jì)菌量極少的樣本（如消毒處理后樣本），在培養(yǎng)計(jì)數(shù)時(shí)可不作稀釋，即使平板菌落數(shù)未達(dá) 15時(shí)，亦可用其計(jì)算最終結(jié)果。 （ 4）稀釋或取液時(shí)要準(zhǔn)確，盡量減少吸管使用中產(chǎn)生的誤差。 殘留消毒劑的去除方法 目 的 在化學(xué)消毒試驗(yàn)中，達(dá)到規(guī)定消毒時(shí)間 終點(diǎn)時(shí)，要求立即終止殘留消毒劑的繼續(xù)作用，以便準(zhǔn)確檢測(cè)出消毒體系中殘留存活的微生物及其數(shù)量。本法同時(shí)含有稀釋作用效果（至少 1:1稀釋，常用 1:10稀釋） ， 是最為普遍使用的方法。 （ 3）稀釋法 將經(jīng)消毒劑作用過(guò)的微生物樣本，用稀釋液稀釋，降低殘留消毒劑濃度，以消除對(duì)微生物的抑制作用。此點(diǎn)由于操作繁瑣，器材需求量大，往往不能認(rèn)真執(zhí)行，應(yīng)加以注意。 （ 3）小平皿（ 4 cm～ 6cm 直徑）。 （ 4）鑒定試驗(yàn)中，消毒后去除殘留消毒 劑 組（第 2組）無(wú)菌生長(zhǎng)，不能表明中和后 受到消毒劑作用后的細(xì)菌是否能恢復(fù)生長(zhǎng)。 【附】中和劑初選試驗(yàn) 中和劑鑒定試驗(yàn)前，若難確定擬檢測(cè)的中和劑，可通過(guò)本試驗(yàn)初選，而后以選中的中和劑進(jìn)行正式的鑒定試驗(yàn)。 第 2組 （消毒劑 + 菌懸液） + 中和劑 → 培養(yǎng) 觀察殘留消毒劑被 中和后受到清毒劑作用后的試驗(yàn)菌是否能恢復(fù)生長(zhǎng)。 按 。 （ 2）第 2組。1℃ 水浴中 5min 后， 加入 ，混勻。吸取 ， 置 20℃ 177。各組分 別用適宜大小容量的無(wú)菌定量吸管按以下程序吸取或添加試劑和試驗(yàn)樣本。1℃ 水浴中 5min 后，用無(wú)菌鑷子夾入一菌 片，并使浸透于消毒液中，待作用至試驗(yàn)預(yù)定時(shí)間，立即用無(wú)菌鑷子取出菌片移入含 中和劑試管中，用電動(dòng)混合器混合 20s，或?qū)⒃嚬苷翊?80 次。 （ 4）第 4 組。作用 10min，立即用無(wú)菌鑷子取出菌片移入含 稀釋液的試管中，用電動(dòng)混合器混合 20s， 或?qū)⒃嚬苷翊? 80 次，混勻。 表 21 中和劑鑒定試驗(yàn)合格標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)第 1 組與第 2 組菌落數(shù)的要求 第 1 組平板平均菌落數(shù) 第 2 組平板平均菌落數(shù) 0 5 X（ 1～ 10） （ X + 5） Y（ 10） （ Y + Y） 注：對(duì)抑菌作用不明顯消毒劑（如乙醇）所用中和劑的鑒定試驗(yàn)中，當(dāng)?shù)? 1 組與第 2 組菌落數(shù)相近，難以達(dá)到本表要求時(shí)，可根據(jù)具體情況另行作出判斷和評(píng)價(jià)。 （ 6）第 6 組。1℃ 水浴中 5min 后，用無(wú)菌鑷子夾入 1 菌片，并使浸透于中和產(chǎn)物溶液中。 如平板生長(zhǎng)菌落數(shù)均超過(guò) 300個(gè)， 應(yīng)重新吸取該最終樣液 ，用稀釋液做適當(dāng)稀釋，選適宜稀釋度懸液，吸取 ，分別接種于平皿中，做活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。吸取消毒劑 ，將其置 20℃ 177。 加入 ， 作用 10min ，用 稀釋液 做 10倍系列稀釋，選適宜稀釋度懸液，各吸取 ，分別接種于平皿中，做活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。用中和劑 做 10倍系列稀釋 ，選適宜稀釋度懸液，各吸取 ，分別接種于平皿中，做活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。1℃ 水浴中 5min 后， 再吸加 ，混勻。 1℃水浴中備用。 第 4組 （消毒劑 + 中和劑） + 菌液 → 培養(yǎng) 觀察中和產(chǎn)物，或未被完全中和的殘留消毒劑對(duì)試驗(yàn)菌的生長(zhǎng)繁殖是否有影響。 （ 2）將 試驗(yàn)菌懸液（含菌量為 1103 cfu/ml～ 3103 cfu/ml）加入含 物試管中，混勻，作用 30min后，取 ，用 TSA傾注法培養(yǎng)。此時(shí)可適當(dāng)縮短作用時(shí)間 重新進(jìn)行試驗(yàn) ，但作用時(shí)間最短不得少于 30s，否則難以控制試 驗(yàn)的準(zhǔn)確性。 （ 5） 稀釋液 ：見(jiàn)附錄 A。 （ 4）所用方法適宜與否，和消毒劑性質(zhì)、復(fù)方中的附加成份、試驗(yàn)微生物種類、消毒試驗(yàn)種類等等均有關(guān)系，試驗(yàn)條件稍有改變就可能影響除藥效果。本法可單獨(dú)使用，但更常見(jiàn)的是與其它方法同 時(shí)使用。所以，在消毒試驗(yàn)前仍應(yīng)將擬用中和劑按試驗(yàn)具體情況，經(jīng)鑒定合格后再使用。殘留消毒劑的去除（下簡(jiǎn)稱除藥），可排除殘留消毒劑對(duì)微生物的抑制，從而使試驗(yàn)獲得正確結(jié)果。 （ 6）樣液接種于平皿后應(yīng)盡快傾注營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，避免樣液干燥于平皿上，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。菌量單位為 cfu。 （ 8）每日觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。必要時(shí)，還可作某稀釋度的 1:1或 1:4稀釋。具體方法如下 : 取含 稀釋液無(wú)菌試管，對(duì)菌片或小型固體樣本直接投入即可，對(duì)棉拭則將其采樣端剪入管內(nèi)，每管一份樣本。 試驗(yàn)器材 （ 1）刻度吸管（ 、 ）。作為菌懸液含菌濃度或菌片染菌量的正式報(bào)告（如殺菌試驗(yàn)中陽(yáng)性對(duì)照組菌懸液或菌片所含菌量），必須以活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)的實(shí)測(cè)結(jié)果為準(zhǔn)，不得使用根據(jù)比濁法判定的估計(jì)值。細(xì)菌繁殖體，可直接使用經(jīng) 18h～ 24h培養(yǎng)的斜面培養(yǎng)物，細(xì)菌芽孢可使用 4℃ 冰箱貯存液。 （ 2）所用載體（除濾紙片外）于染菌前，應(yīng)進(jìn)行脫脂處理。 有效使用期為半年。 5）必要時(shí)，將盛裝菌懸液的三角燒瓶置 45℃ 水浴中 24h，使菌自溶斷鏈，分散成單個(gè)芽孢。將平皿蓋好，放 54℃ ～ 56℃ 條件下，加熱 30min。挑取上述第 2 代培養(yǎng)物中典型菌落，接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，于 37℃ 培養(yǎng) 18h～ 24h，即為第 3 代培養(yǎng)物。隨后，用 移至另一無(wú)菌試管中，用電動(dòng)混合器混合 （振蕩） 20s，或在手掌上振敲 80次，以使細(xì)菌懸浮均勻。 （ 12）數(shù)字可調(diào)移液器（ 10μl，