【正文】 驗 證 名 稱： 有 效 期： 上述方法已按驗證方案進行驗證，各項驗證結(jié)果符合標準要求，批準按此方法進行本品的控制菌檢查。 驗證總負責人： 年 月 日 備注：微生物限度檢查檢驗方法驗證報告驗 證 情 況驗證概述我公司于年月日～年月日對微生物限度檢查方法進行了方法學驗證，在驗證過程中分別取用了大腸埃希菌 [CMCC(B)4410金黃色葡萄球菌 [CMCC(B)26003]、枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]、白色念珠菌 [CMCC(F)98001]、黑曲霉[CMCC(F)98003]菌種，對微生物限度的計數(shù)方法以及控制菌檢查方法進行了驗證。按照驗證方案中的方法進行驗證，以證明其微生物檢驗方法是可靠的，使其產(chǎn)品的檢驗更具有說服力。姓名： 年 月 日驗證評價和建議本次驗證按照經(jīng)批準的驗證方案執(zhí)行，驗證過程中未對驗證方案進行修改，也未產(chǎn)生偏差，驗證試驗項目無遺漏，驗證記錄完整，驗證數(shù)據(jù)可靠，驗證試驗結(jié)果符合要求。菌液組的平均菌落數(shù)100%；回收率應均不低于70％檢驗人： 日期： 復核人： 日期： 試驗組菌回收率計算菌種名稱批號菌落計數(shù)（cfu/皿）回收率試驗組供試品對照組菌液組大腸埃希菌平均值金黃色葡萄球菌平均值枯草芽孢桿菌平均值白色念珠菌平均值黑曲霉平均值表中：回收率=（試驗組的平均菌落數(shù)供試品對照組的平均菌落數(shù)）247。稀釋劑回收率為： %、 %、 %、 %、 %。附錄微生物檢驗方法驗證方案一 概 述：通過驗證以確認所采用的微生物限度檢測方法適合于湖南金旺稀貴藥業(yè)有限公司所生產(chǎn)原料藥的細菌、霉菌及酵母菌的測定；確認所采用的方法適合于所生產(chǎn)原料藥的控制菌的檢查。二 目 的：通過驗證確認所采用的方法適合于所生產(chǎn)原料藥的微生物限度的測定。四 責 任 人：驗證小組成員及相關(guān)人員。大腸埃希菌為革蘭氏陰性菌，金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性菌，枯草芽孢桿菌為產(chǎn)芽孢桿菌，這三種菌株為細菌計數(shù)驗證用菌株；黑曲菌為霉菌，白色念珠菌為酵母菌，作為霉菌和酵母菌計數(shù)驗證用菌株。細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法的驗證，應進行細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法的驗證，以確認所采用的方法適用于該藥品的細菌、霉菌及酵母菌的測定。 驗證菌菌液制備 大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌菌液制備：接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至10ml營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，35～37℃培養(yǎng)18～24小時。 白色念珠菌菌液制備：接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至10ml改良馬丁培養(yǎng)基中，23～28℃培養(yǎng)24～28小時；%無菌氯化鈉溶液9ml，采用10倍遞增稀釋法稀釋至106～107，制成每1ml含菌數(shù)50～100cfu的孢子懸浮液。 供試液的制備 無抑菌活性的供試品供試液的制備 稀釋劑： 液體供試品：供試品10ml置錐形瓶中，加90ml稀釋劑，混勻，作為供試液 （1：10）。 具有抑菌活性的供試品試液的制備 當供試品具有抑菌活性時，須先消除抑菌活性，其方法如下： 培養(yǎng)基稀釋法：取供試液2ml，；，傾注15ml的培養(yǎng)基，測定細菌、霉菌及酵母菌的菌數(shù)，混勻，凝固，培養(yǎng)。計算每1ml供試液的平均菌落數(shù)，按平皿法技術(shù)規(guī)則報告菌數(shù)。 離心沉淀集菌法：取一定量的供試液，3000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘（供試液如有沉淀，先以500轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，取全部上清液再離心），棄去上清液，留底部集菌液約2ml，加稀釋液補至原量。 中和法：選取適宜的中和劑消除供試品的抑菌活性后測定。采用平皿法，取試驗用的1ml菌液（約50～100cfu）分別注入平皿中，立即傾入培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌落數(shù)。（平皿法）：取試驗可能用的最低稀釋級1ml供試液分別注入N個平皿中，每個平皿再注入50～100cfu試驗菌，分別注入平皿中，立即傾入培養(yǎng)基，每株試驗菌平均制備2個平皿，按平皿法測定其菌落數(shù)。至少要一張膜。 供試品對照組取規(guī)定量供試液，按菌落計數(shù)方法測定供試品本底菌數(shù)（方法和試驗組相同）。用稀釋劑代替供試品，加入試驗菌。 回收率計算 試驗組回收率計算試驗組的菌回收率=100% 稀釋劑對照組回收率計算試驗組的菌回收率=100%計數(shù)方法驗證至少應進行3次獨立平行試驗，并分別計算各試驗菌每次試驗的回收率。2. 控制菌檢驗方法與驗證當建立藥品的微生物限度檢查時，應進行控制菌檢查方法的驗證，以確認所采用的方法適合于該藥品的控制菌檢查方法測定。驗證試驗也可與供試品的控制菌檢查同時進行。 菌液制備大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型付傷寒沙門菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養(yǎng)物至10ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，35～37℃培養(yǎng)18～24小時；%無菌氯化鈉溶液，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至105～107，制成每1ml含菌數(shù)10～100cfu的菌懸液。方法同試驗組，驗證大腸埃希菌、大腸菌群、沙門菌檢查法時的陰性對照菌采用金黃色葡萄球菌；驗證銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、梭菌檢查方法時的陰性對照菌采用大腸埃希菌。 試驗組 常規(guī)法 大腸埃希菌：取相當于1g或1ml供試品的供試液至100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，陽性菌對照組加入大腸埃希菌10～100cfu，陰性菌對照加入金黃色葡萄球菌10～100cfu，35～37℃培養(yǎng)18～24小時，取此培養(yǎng)物按《微生物限度檢測標準操作規(guī)程》大腸埃希菌項下規(guī)定檢查。 沙門菌：取供試品10g或10ml，直接或處理后接種至適量（不少于200ml）的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，用均漿儀或其他適宜方法混勻，陽性菌對照加沙門菌10～100cfu，陰性菌對照加入近換色葡萄球菌10～100cfu，35～37℃培養(yǎng)18～24小時。 銅綠假單胞菌：取相當于1g或1ml供試品的供試液至100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，陽性菌對照加入銅綠假單胞菌10～100cfu，陰性菌對照加入大腸埃希菌10～100cfu35～37℃培養(yǎng)18～24小時。 金黃色葡萄球菌：取相當于1g或1ml供試品的供試液至100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，陽性菌對照加入銅綠假單胞菌10～100cfu，陰性菌對照加入大腸埃希菌10～100cfu35～37℃培養(yǎng)18～24小時。 培養(yǎng)基稀釋法：供試品有抑菌作用，放大培養(yǎng)基量由1：100放大到1：300、1：500或1：1000，由于容器提及限制，一般放大到500ml或1000ml，本法適用于抑菌作用不簽的樣品。 中和法：在供試品溶液中加入相應的中和劑一減除供試品中抑菌成份的作用，中和劑應對微生物無毒性，與抑菌成份結(jié)合后的產(chǎn)物應對微生物無毒性，或有毒性但不影響待檢菌的檢出。陰性菌對照組不得檢出陰性對照菌。3. 驗證的實施 細菌、霉菌、酵母菌計數(shù)方法驗證記錄及控制菌檢驗方法驗證記錄（見附錄）。 驗證過程中發(fā)生的異常情況，按照《偏差處理程序》進行處理。5. 附錄《微生物限度檢測標準操作規(guī)程》微生物限度檢驗方法驗證方案本方案適用于本公司各品種微生物限度檢驗方法的驗證。項目責任人：負責驗證方案的起草及具體實施。QA現(xiàn)場監(jiān)控員：負責驗證實施過程中的監(jiān)督檢查，取樣，確保結(jié)果的可靠性。QC檢驗員：負責驗證方案的起草與參與實施，并對所測數(shù)據(jù)準確性負責。通過驗證以確認所采用的方法適合于該藥品的細菌、霉菌及酵母菌的測定；確認所采用的方法適合于該藥品的控制菌的檢查。若符合，按驗證的方法和條件進行藥品的微生物限度檢查；若不符合，重新建立制訂檢驗方法和檢驗條件，再進行驗證，直至驗證結(jié)果符合設立的驗證標準。.驗證試驗可與供試品的細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)同時進行。 大腸埃希菌為革蘭氏陰性菌，金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性菌，枯草芽孢桿菌為產(chǎn)芽孢桿菌，前述菌株作為細菌計數(shù)驗證用菌株；黑曲霉為霉菌，白色念珠菌為酵母菌，作為霉菌及酵母菌計數(shù)驗證用菌株。、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌菌液制備：接種大腸埃希菌、金色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至10ml營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，35～37℃培養(yǎng)18～24小時。：接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至10ml改良馬丁培養(yǎng)基中，23～28℃培養(yǎng)24～48小時；%無菌氯化鈉溶液9ml，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至106~107，制成每1ml含菌數(shù)50～100cfu的菌懸液。. 供試液的制備◆稀釋劑：◆液體供試品：供試品10ml置錐形瓶中，加入90ml稀釋劑，混勻，作為供試液（1：10）。當供試品具有抑菌活性時，須先消除抑菌活性，其方法如下：◆培養(yǎng)基稀釋法：取供試液2ml，；，傾注15ml的培養(yǎng)基，測定細菌、霉菌及酵母菌的菌數(shù)，混勻，凝固，培養(yǎng)。計算每1ml供試液的平均菌落數(shù)， 按平皿法計數(shù)規(guī)則報告菌數(shù)；控制菌檢查時可加大增菌液的用量?！舯∧み^濾法：取規(guī)定量試驗可能用的最低稀釋級供試液，過濾，沖洗，按薄膜過濾法測定其菌落數(shù)。. 菌液組 測定所加的試驗菌數(shù)。：取試驗可能用的最低稀釋級1ml供試液和50～100cfu試驗菌，分別注入平皿中，立即傾入培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌落數(shù)。：取規(guī)定量試驗可能用的最低稀釋級供試液，過濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入50～100cfu試驗菌，過濾，按薄膜過濾法測定其菌落數(shù)。：取規(guī)定量試驗可能用的最低稀釋級供試液，如供試液含許多藥渣，先以500轉(zhuǎn)/分鐘離心3~5分鐘，取全部上清液，再以3000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，取下面1ml液體，并用稀釋劑洗滌管底，將洗滌液與1ml液體一起采用平皿法或薄膜過濾法計數(shù)。若供試液需要分散、乳化、中和、離心或薄膜過濾法等處理時，應增加稀釋劑對照組，用稀釋劑代替供試品，加入試驗菌，使最終濃度為每1ml 供試液含50～100cfu，按試驗組的供試液制備方法和計數(shù)方法計數(shù)。 在3次獨立的平行試驗中，稀釋劑對照組的菌回收率（稀釋劑對照組的平均菌落數(shù)占菌液組的平均菌落數(shù)的百分率）≥70%。照該供試液制備方法和計數(shù)法測定供試品的細菌、霉菌及酵母菌數(shù)；若任一次試驗中試驗組的菌回收率低于70%，應采用自然沉降法、培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀集菌法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新進行方法驗證，使試驗組菌回收率大于70%。若藥品的組分或原檢驗條件發(fā)生改變可能影響檢驗結(jié)果時，檢驗方法應進行重新驗證。大腸埃希菌（Esherichia coli）【CMCC(B) 44102】、金黃色葡萄球菌（ Staphylococcus）【CMCC(B)26003】、乙型付傷寒沙門菌（Salmonella paratyphi B）【CMCC(B) 50094】、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）【CMCC (B) 10104】驗證實驗所用的菌株傳代次數(shù)不得超過5代 （從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為0 代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)，以保證試驗菌株的生物學特性。 設立陰性菌對照組是為了驗證該控制菌檢查方法的專屬性。陰性對照菌不得檢出?！舸竽c菌群 取含適量（不少于10ml）的膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基管3支，分別加入含供試品1g或1ml 、陽性菌對照加入大腸埃希菌10～100cfu，陰性菌對照加入金黃色葡萄球菌10～100cfu，35～37℃培養(yǎng)18～24小時，按《微生物限度檢查SOP》大腸菌群項下規(guī)定檢查。按《微生物限度檢查SOP》沙門菌項下規(guī)定檢查。按《微生物限度檢查SOP》沙門菌項下規(guī)定檢查。按《微生物限度檢查SOP》金黃色葡萄球菌項下規(guī)定檢查。. 薄膜過濾法 采用薄膜過濾法時，取規(guī)定量供試液，過濾，沖洗，試驗菌應加在最后一次沖洗液中，過濾后，注入培養(yǎng)基或取出濾膜接入增菌培養(yǎng)基中。 在供試品溶液中加入相應的中和劑，以減除供試品中抑菌成分的作用，中和劑應對微生物無毒性，與抑菌成分結(jié)合后的產(chǎn)物應對微生物亦無毒性，或有毒性但不影響待檢菌的檢出。陰性菌對照組不得檢出陰性對照菌。、霉菌及酵母菌計數(shù)方法驗證記錄及控制菌檢驗方法驗證記錄(見附件)。，按照《偏差處理程序》進行處理。檢查項目包括細菌數(shù)、真菌數(shù)、酵母菌數(shù)及控制菌檢查。檢查全過程必須嚴格遵守無菌操作，防止再污染。除另有規(guī)定外，本檢查法中細菌的培養(yǎng)溫度為30～35℃，真菌、酵母菌的培養(yǎng)溫度為25～28℃，控制菌培養(yǎng)溫度為（36177。檢驗結(jié)果的報告以1g、1ml、10g、10ml為單位報告。除另有規(guī)定外，一般供試品的檢驗量為10g或10ml。2 儀器設備 YXQLS30SII型立式壓力蒸汽滅菌器 雙人凈化工作臺 150A型培養(yǎng)箱 2022型干燥箱 微波爐 架盤天平 YJA電動勻漿儀3 供試液的制備根據(jù)供試品的理化特征與生物學特征，可采取適宜的方法制備供試液