sds-聚丙烯酰胺凝膠-閱讀頁
2025-05-22 18:13本頁面
【正文】 ? ? 以已知蛋白質(zhì)分子量的常用對數(shù)值為縱坐標， ? Rf為橫坐標繪圖 Rf值，便可在標準曲線上 ? 讀出他的分子量 * — . ? b. SDS凝膠電泳法測定分子量，每次測定樣品必須同時做 ? 標準曲線，而不得利用另一次電泳的標準曲線。 ? ② 帶有烷基化作用的還原 SDS處理 烷基化作用可以很好地并經(jīng)久牢固地保護 SH基團，而得到窄的電泳帶。 (5) 固定 (6) 染色 考馬斯亮藍（ coomassie brilliant blue） ① R250 三苯基甲烷，紅藍色，每個分子含有兩個 SO3H基團，偏酸性，和氨基黑一樣也是結合在蛋白質(zhì)的堿性基團上 。 (7)照相，凝膠干燥 (8) 定量測定 （ 1） “ 微笑 ” 現(xiàn)象 指示劑前沿呈現(xiàn)兩邊向上的曲線形，說明凝膠的 不均勻冷卻，中間部分冷卻不好。 ? (3)“ 拖尾 ” 現(xiàn)象 樣品溶解不佳引起 ? (4)“ 紋理 ” 現(xiàn)象 由于樣品中的不溶顆粒引起的 。 ? Western使用的探針是 抗體 ，它與附著于固相支持體的靶蛋白所呈現(xiàn)的 抗原表位 發(fā)生特異性反應。 ? 步驟 : ? :蛋白質(zhì)行 SDSPAGE電泳并從聚丙烯酰胺凝膠上 ? 轉(zhuǎn)移至固相載體上 . ? :保持膜上沒有特殊抗體結合的場所 ,使場所處于飽 ? 和狀態(tài) ,用以保護特異性抗體結合到膜上并與蛋白 ? 質(zhì)反應 . ? (第一抗體 ):特異性 ? :與一抗特異性結合并作為指示劑 ? ? 封閉：用一種與待測物不反應的物質(zhì) (如蛋白質(zhì)、 ? tween 20等 )封阻載體印跡區(qū)域以外的剩余 ? 吸附位點 ,使探針與印跡反應 ,且不吸附到 ? 載體上 ,此過程稱為封閉 . ? 封閉目的 :使印跡結果背景干凈 ,印跡的斑點或譜 ? 帶更為清晰 . ? *第一階段為 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDSPAGE)。此階段分離效果肉眼不可見 (只有在染色后才顯出電泳區(qū)帶 )。 ? 將在凝膠中已經(jīng)分離的條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，選用低電壓(100V)和大電流 (1—2A)，通電 45min轉(zhuǎn)移即可完成。 ? 第三階段為 酶免疫 定位。常用的 HRP底物為 3， 3， —二氨基聯(lián)苯胺(呈硝酸纖維素膜棕色 )和 4—氯 —1—萘酚 (呈藍紫色 )。 ? 優(yōu)點 : ? ? ,可在膜上對蛋白質(zhì)進行多種檢測和鑒定 . ? 例 :放射自顯影、染色、酶標免疫等 ? ? 應用： ? ? ? 同一蛋白質(zhì)在不同細胞或統(tǒng)一細胞不同條件 ? 下的相對含量分析 . ?
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