單克隆抗體ppt課件-閱讀頁
2025-05-21 13:10本頁面
【正文】 測(cè)定時(shí)，把受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)，形成抗原抗體復(fù)合物（帶有酶），加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺進(jìn)行定性或定量分析。 ? 按順序加樣，孔底無氣泡。 ? 將融合的細(xì)胞進(jìn)行充分稀釋，使分配到培養(yǎng)板的每一孔中的細(xì)胞數(shù)在 0至數(shù)個(gè)細(xì)胞之間，培養(yǎng)一段時(shí)間后取上清以 ELISA法選出抗體高分泌性的細(xì)胞。 ? 找出針對(duì)目標(biāo)抗原的抗體陽性細(xì)胞株，增殖后凍存、體外培養(yǎng)或動(dòng)物腹腔接種培養(yǎng)生產(chǎn)抗體?；蛟偌悠⒓?xì)胞。 ? c. 按每毫升加入 5 1041 105細(xì)胞的比例，在上述雜交瘤細(xì)胞懸液中分別加入腹腔巨噬細(xì)胞。 ? e. 37℃ 、 % CO2濕潤(rùn)培養(yǎng) 710天，出現(xiàn)肉眼可見的克隆即可檢測(cè)抗體；在倒置顯微鏡下觀察，標(biāo)出只有單個(gè)克隆生長(zhǎng)的孔，取上清作抗體檢測(cè)。 ? （ 2） 軟瓊脂法 ? a. 在培養(yǎng)皿中制備飼養(yǎng)細(xì)胞（小鼠腹腔細(xì)胞）單層。 ? c. 吸去平皿上層培養(yǎng)液，加入 1%瓊脂糖培養(yǎng)液3ml，室溫 10分鐘。 ? e. 37℃ 、 %濕潤(rùn)培養(yǎng) 714天；克隆生長(zhǎng)至2mm時(shí)，用毛細(xì)吸管吸出克隆，直接轉(zhuǎn)種于含有飼養(yǎng)細(xì)胞的 24孔板，擴(kuò)大培養(yǎng)。 細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇 ? 在雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)后，應(yīng)該凍存一部分細(xì)胞。細(xì)胞凍存幾個(gè)月后要進(jìn)行復(fù)蘇，對(duì)細(xì)胞活力和分泌抗體的能力進(jìn)行檢測(cè)。待腫瘤 達(dá)到一定大小后 (一般10～ 20天 )則可采血，從血清中獲得單克隆抗體含量可達(dá)到 110mg／ ml。 ? （ 2）腹水制備法 ? 腹腔注射 1 106 個(gè)雜交瘤細(xì)胞，接種細(xì)胞 7～ 10天后可產(chǎn)生腹水，處死小鼠，用滴管將腹水吸入 試管中，一般一只小鼠可獲 1～ 10ml腹水。 ? 腹水中單克隆抗體含量可達(dá) 5～ 20mg/ml， 這是 目前最常用的方法。 9. 單抗的純化 ? （ 1） 腹水的處理 在單抗純化之前，一般均需對(duì)腹水進(jìn)行預(yù)處理，目的是為了進(jìn)一步除去細(xì)胞及其殘?jiān)⑿☆w粒物質(zhì)、以及脂肪滴等。 ? ： 新鮮采集的腹水（或凍存的腹水）， 2022r/min 15分鐘，除去細(xì)胞成分（或凍存過程中形成的固體物質(zhì)）等；取上層清亮的腹水，等量加入 ；然后以每 10ml稀釋腹水中加 150mg二氧化硅粉末，混勻，懸液在室溫孵育 30分鐘，不時(shí)搖動(dòng)；2022g離心 20分鐘，脂質(zhì)等通過該法除去，即可得澄清的腹水。 ? ：即上述兩法的組合，先將腹水高速離心，取上清液再用二氧化硅吸附處理。 ? B、 辛酸 硫酸銨沉淀法 該法簡(jiǎn)單易行，適合于提純 IgG1和 IgG2b，但對(duì) IgG3和 IgA的回收率及純化效果差。 （ 3）單抗的純化 ? 單抗純化的方法有很多種，應(yīng)根據(jù)具體單抗的特性和實(shí)驗(yàn)條件選擇適宜的方法，常用的技術(shù)有 DEAE離子交換層析柱、凝膠過濾法和親和層析法三種。 ? （ 2）大規(guī)模、長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)過程中分泌產(chǎn)物能力易丟失，或產(chǎn)物活性易降低活性易降低。因此大多僅能在小規(guī)模范圍內(nèi)研究，難以轉(zhuǎn)化為生產(chǎn)力。 ? （ 5）在線監(jiān)測(cè)水平技術(shù)不完善，限制了優(yōu)良培養(yǎng)系統(tǒng)的開發(fā)。 ? （ 2） 開發(fā)能高密度生長(zhǎng)、大量分泌目標(biāo)產(chǎn)品的細(xì)胞系。 ? （ 4） 研制高效的培養(yǎng)模式與系統(tǒng)，包括新型的無菌包括新型的無菌生物反應(yīng)器培養(yǎng)系統(tǒng)與工藝、先進(jìn)的在線檢測(cè)、分析與自動(dòng)控制技術(shù)等。 人源化單克隆抗體 ? 鼠源性單抗的局限： ? 不能激活補(bǔ)體及 Fc受體； ? 易被人體識(shí)別排斥； ? 易清除。 它能自發(fā)折疊成天然構(gòu)象，與抗原的結(jié)合力維持與原來完整抗體一樣。 由于 Ig的 C區(qū)是人源的，這種抗體對(duì)人的免疫性就大為降低，采用不同亞類的人 C區(qū)基因，便可改變抗體的效應(yīng)功能，以獲抗腫瘤的最佳效果。 即：人化抗體 組合抗體庫技術(shù) ? 1985年 Smith將一基因片段克隆到載體噬菌體 fdtet的基因 Ⅲ （ g3）上，發(fā)現(xiàn)該基因所表達(dá)的蛋白與噬菌體基因 Ⅲ 表達(dá)的蛋白結(jié)合在一起呈現(xiàn)到噬菌體表面。 ? 目的基因表達(dá)的蛋白如若想在噬菌體表面呈現(xiàn)，就必須插在這 5種外殼的其中一處。 ? 利用這一系統(tǒng)可以構(gòu)建表達(dá)性基因文庫，稱為噬菌體呈現(xiàn)文庫。 ? 雖然利用動(dòng)物的免疫可以獲得循環(huán)多克隆抗體，用細(xì)胞融合方法可以獲得單克隆抗體，但利用基因工程的技術(shù)構(gòu)建抗體基因庫，再篩選所需的特異性抗體，不僅擺脫了繁重的工作量，也可獲得大量的、穩(wěn)定的抗體。
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