【正文】 出很大的優(yōu)越性。 ΔA ＝ Aλ2 － Aλ1 ＝ (ελ2 － ελ1)b c ?兩波長處測得的吸光度差值 ΔA與待測組分濃度成正比。 雙波長分光光度法 關鍵問題 ?測量波長 λ2和參比波長 λ1的選擇與組合 ?以兩組分 x和 y的雙波長法測定為例： ?設： x為待測組分， y為干擾組分，二者的吸光度差分別為 : ΔAx和 ΔAy。 波長組合 λ1 、 λ2的基本要求是： ⑴選定的波長 λ1和 λ2處，干擾 組分應具有相同吸光度，即： ΔAy = ΔA yλ2 ΔA yλ1 = 0 故： ΔAx+y = ΔA x=(εxλ2εxλ1)bcx ? 此時：測得的吸光度差 ΔA只與待測組分 x的濃度呈線性關系，而與干擾組分 y無關。 ⑵在選定的兩個波長 λ1和 λ2處待測組分的吸光度應具有足夠大的差值。 分光光度法的具體應用 蛋白質測定 雙縮脲法 考馬斯亮藍 G250染色法 核酸測定 葉綠素的測定 蛋白質測定 ?蛋白質的分析是生物化學和其它生物學科、食品檢驗、臨床診斷等領域最常涉及到的分析檢測手段。分光光度法是目前最常用的一種方法． (1) 雙縮脲法 ? 利用雙縮脲反應，蛋白質與二價銅離子在堿性溶液中形成紫色絡合物，最大吸收波長在 540nm，可測定含有 101200 ug/mL蛋白質樣品，標準曲線的線性關系和重復性好． ? 雙縮脲試劑：硫酸銅 ，酒石酸鉀鈉 6g，碘化鉀 1g，溶于適量水，攪拌狀態(tài)下加入 300mL 10％氫氧化鈉溶液，用水稀釋至 1000mL，在塑料瓶中貯存． ? 標淮曲線繪制及樣品測定：在試管中分別加入 ， ， 、 ， ， ，用水補足到 ，另取一份 ，上述溶液中分別加入 劑，混均后室溫放置 15min， 540nm處測定． (2) 考馬斯亮藍 G250染色法 ? 考馬斯亮藍 G250，在酸性溶液中為棕紅色，它和蛋白質通過疏水作用結合后產生顏色反應呈藍色。 ? 配制顯色劑：將 100mg考馬斯亮藍 G250溶解于 50mL 95％的乙醇中。 ? 配制標準蛋白溶液：在試管中分別加入含 0， 10， 20， 30，40， 50， 60ug的標準蛋白質，加水至 60uL．加 3mL染色液，另取樣品液也加 3mL染色液，混勻后室溫放置 15min。 核酸測定 ?由于核酸和蛋白質通常 (結合在一起 )以核蛋白的形式存在，所以在提純核酸的過程中．要測定其中蛋白質雜質的含量。DNA比值為 ， RNA比值為 。 常涉及到用于測定核酸樣品的波長有 4個 ① 230nm，肽鍵的吸收波長，用此波長檢測蛋白質的含量比 280nm處更靈敏．但常用緩沖液 (如 Tris等 )對測定有干擾。 ③ 260nm，大多數單核苷酸的最大吸收波長均在260nm附近，用來檢測核酸的含量。 ?為使用方便起見，將上述 4種波長按不同組合編成四個固定的指定參數方法。 (2)測定 260nm/280nm及 280nm/260nm的比率，背景校正波長 320nm。 (4)測定 260nm/280nm及 280nm/260nm的比率，用 Warburg和 Christian系數計算蛋白質和核酸濃度。 ? 由于各種核酸、蛋白的差異很大，為了更準確的測定核酸和蛋白質的濃度，用經典濃度公式，即 Warburg和 Christian濃度公式測定核酸和蛋白質濃度． ? 蛋白質 (ug/mL)＝ 1552 A280－ A260 ? 核酸（ ug/mL）＝ A260 － 36 A280 葉綠素的測定 ?將 2g鮮重葉片放在干凈研缽內，加 40mL 80％丙酮，把組織研磨勻漿，研磨大約 3min，小心地把綠色液體轉移到一個墊有濾紙的漏斗內，當過濾提取液時 (抽濾 )，用另外 30mL 80％丙酮重復研磨所剩物成勻漿， 34min之后，如前一樣將第二次提取液過濾到含第一次提取液的燒瓶里。葉綠素有葉綠素 a和葉綠素 b，它們分別有持征吸收光譜。 ?式中 Ca、 Cb分別為葉綠素 a及葉綠素 b的濃度，為了便于區(qū)別用 d代表光徑。 ?另外，葉綠素 a、 b的等吸收點在 652nm，故可在652nm測定。 ?通過酶促反應動力學的研究，有助于了解酶與底物的結合機制和作用方式、酶的底物濃度與蔭促反應速度的關系符合米氏理論。 ?原子吸收光譜法特點： (1) 檢出限低， 1010～ 1014 g； (2) 準確度高，誤差在 1%～ 5%； (3) 選擇性高，一般情況下共存元素不干擾； (4) 應用廣，可測定各種樣品中 70多個元素。 ?當照射停止后，如化合物的發(fā)射在 109秒鐘內停止，則稱熒光 ?超過此限度即稱為磷光。以紫外線作激發(fā)光源，所發(fā)射的熒光常在可見光區(qū)。 原理 ? 設 IF為熒光強度； ? I0入射紫外線強度； ? It為透過溶液后紫外線強度； ? Ia為溶液吸收紫外線； 則： Ia=I0It ? C為溶液中被測物質的濃度； ? l為溶液層的厚度。 只要測出樣品溶液的熒光強度和標準溶液的熒光強度，就可按正比關系計算樣品溶液的濃度。 ?在比色計中光源、比色杯和光電源三者排列成一條直線。 比色計與熒光計兩種裝置不同點之二 ?比色計中光源是普通的鎢絲燈。 比色計與熒光計兩種裝置不同點之三 ?比色計中只有一種光源，只需要一個濾光板 ?熒光計中有兩種輻射、三個濾光板 : ?濾光板 1用于過濾紫外線，除去其中可見光 ?濾光板 2用于過濾熒光，以去除其他顏色的雜光； ?濾光板 3可濾去熒光中夾雜的紫外線 熒光分析的操作 標準曲線法 ? 先配制一第列濃度由大到小的標準管 C1，C C … … ， C1為濃度最大的標準管 作為起始濃度，置熒光計透光率為 100，調節(jié)光柵使檢流計指零。 標準曲線法 ?標準曲線的另一作法是以空白溶液為起始濃度，置熒光計透光率于 10或 20處，調節(jié)光柵使檢流計指零。 比較法 ? 先配一標準溶液，其濃度應略大于樣品溶液，濃度越接近，誤差越小。 ? 然后測定樣品溶液及空白溶液的透光率。 pH的影響 ?大多數熒光反應都受溶液酸堿度的影響，故熒光分析需在適合的酸堿度溶液中進行。 ?所用酸的種類也影響熒光的強度，例如，奎寧在硫酸溶液中的熒光較在鹽酸中的要強些。乙醇、甘油、丙酮、氯仿及苯都是常用的溶劑。 鹽類的影響 ? 能與試劑發(fā)生反應的其他金屬鹽類都應事先除去。 ? 強氧化劑、還原劑及絡合劑均不應存在于溶液中。 ?有的反應需要經過 15~30min達到最高峰。 ?橡皮塞、軟木塞及濾紙中也常有能溶于溶劑的一些帶熒光的物質。