親和色譜ppt課件-閱讀頁
2025-05-20 22:19本頁面
【正文】 的配基，攪拌 2h， 4℃ 保存 這種方法的 缺點(diǎn) 是溴化氰活化法的基質(zhì)和配體偶聯(lián)后生成的異脲衍生物中氨基的 pKa＝ ，所以通常會帶一定的正電荷，從而使基質(zhì)可能有陰離子離子交換作用， 增大了非特異性吸附， 影響親和層析的分辨率。另外溴化氰有 劇毒、易揮發(fā)， 所以操作不便。 這種活化方法的優(yōu)點(diǎn)是活化后不引入電荷基團(tuán)，而且基質(zhì)與配體形成的 N－ C、 O－ C 和 S－ C 鍵都很穩(wěn)定，所以配體與基質(zhì)結(jié)合緊密，親和吸附劑使用壽命長，而且便于在親和層析中使用較強(qiáng)烈的洗脫手段，另外這種處理方法沒有溴化氰的毒性。這樣的條件對于一些比較敏感的配體可能不適用。另外還有甲苯磺酰氯法、雙功能試劑法。 ? 如果在配基與載體之間連接間隔臂，可以增大配基與載體之間的距離，使其與生物大分子發(fā)生有效的親和結(jié)合。spa cer a rmsSma l l l i gand ( 1,00 0)Ri sk of st er i c i nt er f er en ce wi t h b i nd i ng be t ween m at r i x an d t ar ge t m ol e cu l eOft en ne ed sp ac er ar mbut w atc h o ut fo r adsor pti on to the spac er !Spa c e r arm? 加入間臂的長度要恰當(dāng)，太短則效果不明顯；太長則容易由疏水性非特異吸附造成彎曲，反而降低吸附效率。如間臂和配基疏水性較強(qiáng)，則效果不明顯。 ? 金屬離子如 鋅和銅 。 ? 金屬螯合劑： 亞氨二醋酸 、 氨基水楊酸 、 8羥基喹啉 、 羧甲基氨基酸等 . 親和作用機(jī)理 ? 靜電作用 ? 配位鍵結(jié)合 ? 共價(jià)鍵生產(chǎn) ? π 鍵 吸附 ? 采用 50mmol/L的金屬鹽溶液通過色譜柱，直至色譜介質(zhì)吸附飽和。 解吸 吸附蛋白質(zhì)解吸的方法： ? 改變 pH值 ? 競爭性洗脫 ? 采用 50100mmol/L的 EDTA洗脫，可將蛋白質(zhì)和金屬離子解吸，洗滌，重新上柱平衡，固定所需的金屬離子。 ? 需核苷酸類物質(zhì)為輔酶的酶 ， 對染料具有一定親和力 。 ? 染料親和層析已成功的分離純化了多種酶 。 以下途徑可以實(shí)現(xiàn)制備： ? 采用瓊脂糖凝膠，染料連接在 OH上，該過程可在一定條件下直接完成。 吸附蛋白質(zhì)量增多 選擇親和作用力較小的染料有利于解吸 吸附與解吸 ? 采用磷酸鹽緩沖液，在 常用解吸方法： ? 增加鹽濃度 ? 改變 pH值 ? 采用水溶性高聚物 ? 親和洗脫 ? 最后對雜蛋白進(jìn)行變性處理，洗滌、緩沖液平衡再生介質(zhì)。因此用適當(dāng)?shù)姆椒▽⒖乖蚩贵w結(jié)合到吸附劑上 , 便可有效地分離和純化免疫物質(zhì)。 免疫親和色譜過程 目標(biāo)蛋白質(zhì) 抗體制備 上樣與洗脫 介質(zhì)制備 ? 單抗制備復(fù)雜，成本高，但也具有很多優(yōu)點(diǎn)。這些大規(guī)模生產(chǎn)單抗技術(shù)的建立和不斷完善 , 將降低免疫親和色譜吸附劑的價(jià)格。 解吸 ? 特異性解吸 —— 半抗原置換 ? 非特異性解吸 —— 調(diào)節(jié) pH值、加入試劑破壞氫鍵、引入離子對、加入表面活性劑、冷蒸餾水洗滌。將單克隆抗體 Sz 95 LgG 與溴化氰活化的 Spharose 4B 凝膠連接成親和色譜柱 , 人血小板破碎液經(jīng)此親和色譜柱上樣后 , 經(jīng)洗脫獲得 PF4。 基團(tuán)專一性大分子親和色譜 ? 指用對某一類結(jié)構(gòu)相近的物質(zhì)有親和性的大分子作為親和配基偶聯(lián)在色譜介質(zhì)上進(jìn)行的色譜技術(shù)。 親和色譜的應(yīng)用 樣品 tPA的純化 — 酶的抑制劑為親和配基 干擾素的純化 — 免疫親和色譜 脫氫酶的純化 — 色素親和色譜 淀粉酶抑制劑的純化 — 固定化金屬離子親和色譜 基因重組融合蛋白的純化
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