親和色譜ppt課件(已修改)
2025-05-17 22:19 本頁面
【正文】 第十章 親和色譜 在眾多親和分離技術(shù)中，親和色譜是應(yīng)用最多，分離效果最好的技術(shù)。 概述 ? 生物分子能夠區(qū)分結(jié)構(gòu)和性質(zhì)非常接近的其他分子，選擇性地與其中某一種分子相結(jié)合，生物分子間的這種 特異性相互作用 稱為親和作用。 ? 靜電作用、氫鍵等多種作用力對親和作用具有影響。 ? 生物分子間的 親和識別 包括抗體 抗原、酶 底物、激素 受體等親和作用。 常見親合作用體系 特異性 親和體系 高特異性 抗原 單克隆抗體 荷爾蒙－受體蛋白 核酸－互補堿基鏈段、核酸結(jié)合蛋白 酶－底物、產(chǎn)物、抑制劑 群特異性 免疫球蛋白－ A蛋白、 G蛋白 酶－輔酶 凝集素－糖、糖蛋白、細(xì)胞、細(xì)胞表面受體 酶、蛋白質(zhì) 肝素 酶、蛋白質(zhì) 活性色素（染料） 酶、蛋白質(zhì) 過渡金屬離子（銅、鋅等） 酶、蛋白質(zhì)－氨基酸（組氨酸等） 離子強度：一般來說，提高離子強度，親和作用減弱或完成破壞。 PH：在適當(dāng)?shù)?PH下，親和結(jié)合作用較高，在其它 PH下，親和作用減弱或完成破壞。 抑制氫鍵形成的物質(zhì)：脲和鹽酸胍的存在可減弱親和作用 溫度：提高溫度，靜電作用、氫鍵、配位鍵減弱；但是，疏水性相互作用增強 液體離子： SCN、 I、 CIO4的存在，疏水性相互作用減弱 螯合劑：影響配位鍵，使親和作用消失 影響親和作用的因素 ? 利用生物分子之間的專一性識別或特定的相互作用進行分離的技術(shù)為 親和分離技術(shù) ? 親和配基 是對生物分子具有專一性識別或特定的相互作用的物質(zhì) 7 ? 找與底物專一可逆結(jié)合的配基； ? 將配基通過共價鍵偶聯(lián)到基質(zhì)； ? 配基與底物吸附； ? 洗脫目標(biāo)物。 8 親和純化技術(shù) ? 親和層析 (Affinity chromatography) ? 親和過濾（膜分離） ? 親和分配（雙水相萃取） ? 親和反膠團萃?。ǚ茨z團萃?。? ? 親和沉淀（沉淀） ? 親和電泳（電泳） 配基 ? 生物特異性配基 ? 擬生物親和配基 ? 親和配基必須具備的條件： 專一性識別或特異性作用必須是可逆的 結(jié)合常數(shù)要適當(dāng) 穩(wěn)定性好，可進行化學(xué)改性 ? 專一性和特異性 決定著分離純化的產(chǎn)品純度 ? 相互作用的強弱 決定著吸附和解吸的難易程度 親和配基的分類 ? 單專一性的小分子配基 ? 基團專一性的小分子親和配基 ? 專一性的大分子親和配基 ? 免疫親和配基 ? 基團專一性的大分子親和配基 親和配基的選擇 ? 組合化學(xué)肽庫選擇親和配基 目標(biāo)肽 → 反義肽 → 組合合成 → 親和篩選 → 優(yōu)選序列 ? 噬菌體展示技術(shù) 目標(biāo)蛋白 → 可結(jié)合噬菌體 → 擴增 → 多輪篩選單克隆群體 →氨基酸序列 ? SELEX技術(shù) 隨機序列 → PCR擴增 → 特異性結(jié)合 → 重復(fù)篩選 親和洗脫 ? 目標(biāo)產(chǎn)物的洗脫方法有特異性洗脫和非特異性洗脫。 ? 特異性洗脫劑含有與親和配基或目標(biāo)產(chǎn)物具有親和結(jié)合作用的小分子化合物，通過與親和配基或目標(biāo)產(chǎn)物的 競爭性結(jié)合 ，洗脫目標(biāo)產(chǎn)物。 ? 非特異性洗脫通過調(diào)節(jié)洗脫液的 pH、離子強度、離子種類或溫度等降低目標(biāo)產(chǎn)物的親和吸附作用。 親和色譜 ? 親和層析 (Affinity Chromatography， AC)是利用生物大分子具有對一類生物大分子特異識別和可逆結(jié)合的特性而建立起來的一種分離的色譜方法，也叫做生物親和或生物特異性親和色譜。 ? 是親和分離技術(shù)中最具優(yōu)勢的方法 含配體溶液 收集目的蛋白 洗下未結(jié)合的蛋白 混合蛋白樣品 平衡液 帶有配體的樹脂珠（或膠粒） 親和層析的基本特點 純化過程簡單、迅速，且分離效率高 特別適用于分離純化一些含量低、穩(wěn)定性差的生物大分子
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