表達產(chǎn)物的sds聚丙烯酰胺凝膠電泳分離分析鑒定-閱讀頁
2025-05-17 05:15本頁面
【正文】 is甘氨酸緩沖液。 不連續(xù)系統(tǒng)的特點 本文由探生科技技術(shù)人員提供 ,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家 ! 濃縮膠的作用 ? 濃縮膠的作用是有堆積作用，凝膠濃度較小，孔徑較大，把較稀的樣品加在濃縮膠上，經(jīng)過大孔徑凝膠的遷移作用而被濃縮至一個狹窄的區(qū)帶。電泳開始后， HCL解離成氯離子，甘氨酸解離出少量的甘氨酸根離子。 ? 電泳開始時氯離子泳動率最大，超過蛋白，因此在后面形成低電導(dǎo)區(qū)，而電場強度與低電導(dǎo)區(qū)成反比，因而產(chǎn)生較高的電場強度，使蛋白和甘氨酸根離子迅速移動，形成以穩(wěn)定的界面，使蛋白聚集在移動界面附近，濃縮成一中間層。 C. 顯示蛋白質(zhì)樣品分離成數(shù)個區(qū)帶。 蛋白質(zhì)印跡（ western blotting）的概念 本文由探生科技技術(shù)人員提供 ,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家 ! ? 將通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素 /PVDF膜上，然后與能特異性識別待檢測蛋白的一抗（針對待測分子的單克隆抗體或多克隆抗體）進行反應(yīng)； ? 洗滌去除沒有結(jié)合的特異性抗體后，加入二抗（針對一抗的抗體，標記有放射性同位素或生物素）； ? 反應(yīng)一段時間后再次洗滌去除非特異性結(jié)合的標記抗體，加入適合標記物的檢測試劑進行顯色或發(fā)光等，觀察有無特異性蛋白條帶的出現(xiàn)，也可通過條帶的密度大小來進行特異性蛋白的半定量。 ? NGAL基因的蛋白產(chǎn)物具有保護調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶 9的活性，作為小分子鐵配合物結(jié)合蛋白參與機體鐵代謝和天然免疫反應(yīng)等功能。 ? NGAL的 mRNA信息在 NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中有來自不同實驗室登記的多個版本，包含完整編碼區(qū)的有 BC033089和 NM_005564等，編碼區(qū)長為 597 bp，編碼 198個氨基酸，包含了 N端前部長為 20個氨基酸的信號肽序列（為核酸序列的 160 bp）。 NGAL的蛋白三級結(jié)構(gòu)（圖為 NGAL蛋白的同源二聚體）： 本文由探生科技技術(shù)人員提供 ,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家 ! 以往，汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室李恩民教授課題組利用大腸桿菌原核表達系統(tǒng)獲得了 NGAL蛋白，但是由原核表達系統(tǒng)對外源蛋白沒有類似真核細胞中的蛋白修飾，如磷酸化和糖基化，有可能影響這些蛋白在功能研究實驗中的效果，為此，我們選擇了畢赤酵母這種真核表達系統(tǒng)來表達 NGAL蛋白。 3. 按照下表配制 12％分離膠與 4％濃縮膠； 4. 樣品的制備：樣品和標準蛋白分別與 5倍上樣緩沖液按 5： 1的比例混勻，并在 100度沸水浴中煮 5min，取出待用； SDSPAGE凝膠的制作 本文由探生科技技術(shù)人員提供 ,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家 ! 分離膠 (12%) 濃縮膠 (4%) 超純水 ml 3 ml 30% Acr/Bis 4 ml Buffer 10% SDS 100 181。l 10% Ap 50 181。l TEMED 5 181。l 凝膠的成分 聚丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性，操作時要戴手套 本文由探生科技技術(shù)人員提供 ,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家 ! 5. 按比例配好分離膠 ,用移液管快速加入，大約 5厘米左右 ,之后加少許蒸餾水（或異丙醇除泡），靜置至膠凝固； ? 凝膠配制過程要迅速 , 催化劑 TEMED要在注膠前再加入，否則凝結(jié)無法注膠。 梳子需一次平穩(wěn)插入，梳口處不得有氣泡 ,梳底需水平。l ? 樣品 20 181。l 共 25181。 ? 蛋白質(zhì)印跡操作 本文由探生科技技術(shù)人員提供 ,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家 ! ? 將 PVDF膜先置于 100%甲醇中浸濕 15s，然后移至超純水中浸泡 2min，最后轉(zhuǎn)至轉(zhuǎn)移液中至少平衡 5min； ? 電泳完畢的凝膠，剝落到轉(zhuǎn)移液中平衡 30min，將轉(zhuǎn)印用的濾紙和海綿墊均用轉(zhuǎn)移液浸濕； ? 將夾子打開使黑的一面保持水平，在上面墊一張海綿墊，用玻棒搟走里面的氣泡，在墊子上墊 2張 10 10 cm的濾紙，用玻棒搟去其中的氣泡； ? 從轉(zhuǎn)移液中取出平衡好的分離膠蓋于濾紙上，用玻棒搟去氣泡，將平衡好的PVDF膜蓋于膠上，并去除氣泡； ? 在膜上蓋 2張 cm的濾紙并除去氣泡，最后蓋上另一個海綿墊，搟幾下就可合起夾子； ? 將夾子放入轉(zhuǎn)移槽槽中， 60V轉(zhuǎn)移 2h，將膜用超純水漂洗一下，室溫晾干 ； 蛋白質(zhì)印跡操作步驟 本文由探生科技技術(shù)人員提供 ,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家 ! 蛋白印跡系統(tǒng) 本文由探生科技技術(shù)人員提供 ,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家 ! 免疫檢測的操作 ? 將膜用 100％甲醇浸濕 5min，再用超純水漂洗一下，移至含有 50ml封閉液的平皿中，室溫下脫色搖床上搖動封閉 1h； ? 將一抗（大鼠抗人 NGAL單克隆抗體）用封閉液 1： 200稀釋；鋪保鮮膜于實驗臺面，將抗體溶液（每張膜 500181。l液體），室溫下孵育 2h； ? 用 PBST在室溫下脫色搖床上漂洗兩次，每次 5min，再用 PBS漂洗一次， 5min，進行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。 7. 請結(jié)合實驗一“蛋白質(zhì)各種定量方法優(yōu)缺點的比較”，選擇適當(dāng)?shù)姆椒z測外源基因在酵母中的表達量，并說明理由。我們還用基因表達芯片分析了這兩個基因下調(diào)后其他基因的表達情況，發(fā)現(xiàn)有多個鋅指蛋白發(fā)生了明
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