dnarna合成常見(jiàn)問(wèn)題解答-閱讀頁(yè)
2025-04-08 04:50本頁(yè)面
【正文】 長(zhǎng)的寡核苷酸的純化(50100 mer)，我們推薦PAGE純化法，它使用交連的聚丙烯酰胺凝膠作為純化基質(zhì)?！?mer寡核苷酸如何被純化呢? ↑TOP通常，長(zhǎng)核苷酸(大于50 mer)被推薦使用PAGE純化法。氨基和339。 寡核苷酸末端最初的脂肪族胺基團(tuán)會(huì)在合成過(guò)程中，連接上許多胺反應(yīng)性的分子。539。磷酸化：磷酸化的寡核苷酸通常用于定點(diǎn)突變和接頭插入。巰基修飾法：末端巰基修飾的寡核苷酸可以進(jìn)一步衍生出巰基反應(yīng)分子。539。 生物素化的寡核苷酸具有多種用途，包括比色法測(cè)定DNA和借助抗生物素蛋白鏈菌素包被的磁珠進(jìn)行固相捕獲，用于限制性內(nèi)切酶圖譜、基因組步移和差異顯示。熒光素，339。 熒光染料標(biāo)記的寡核苷酸已經(jīng)被廣泛用于DNA自動(dòng)測(cè)序，定量PCR和原位雜交反應(yīng)。此外，它的吸收率相對(duì)較高，產(chǎn)生的熒光量子數(shù)量多，與氬離子激光器在488 nm的激發(fā)光譜相近，使它成為共聚焦激光掃描顯微鏡法中常用的熒光基團(tuán)，并用于流式細(xì)胞計(jì)數(shù)。盡管有這些缺陷，熒光素仍因它的優(yōu)點(diǎn)被廣泛的用做熒光染料。 TAMRA及339。 Rhodamines與具有光漂白易感性和pH依賴性的熒光素相比見(jiàn)光更穩(wěn)定。玫瑰紅中最普遍的基團(tuán)是TAMRA，它是一種用于寡核苷酸標(biāo)記和DNA自動(dòng)測(cè)序的重要的熒光物質(zhì)。但是，由于TAMRA很容易被水銀燈形成的546 nm光譜激發(fā)，被熒光顯微鏡觀察，而且本質(zhì)上它比熒光素更不易感光。TAMRA也可被543 nm的綠色的HeNe激光有效的激發(fā)，它很大程度上被用于分析儀器。539。 Cy5修飾法：間隔物(spacer)修飾法：包括了多種在寡核苷酸與后續(xù)連接標(biāo)記之間的間隔序列的亞磷酰胺的合并，在標(biāo)記物與寡核苷酸探針進(jìn)行原位雜交反應(yīng)時(shí)，這種方法可能是很重要的。 脫氧肌苷以這種穩(wěn)定性順序I:C I:A I:T=I:。硫磷酰修飾法：我們可以依據(jù)用戶的需要，在寡核苷酸部分序列中用硫磷?；脫Q核苷酸內(nèi)部的磷酸基(在磷酸基中用一個(gè)硫原子代替一個(gè)氧原子)。熒光素339。 539。 TAMRA 修飾)：他們或者在反應(yīng)中裂開(kāi)(如TaqMan探針)或者在互補(bǔ)目的DNA存在的情況下經(jīng)歷一種構(gòu)型變化(如分子信標(biāo))。實(shí)際上，通過(guò)除去供體熒光基團(tuán)的淬滅作用，探針可指示反應(yīng)的發(fā)生。 核酸酶測(cè)定法(TaqMan探針)：核酸酶測(cè)定法被用來(lái)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)反應(yīng)。核酸外切酶的活性來(lái)檢測(cè)正在進(jìn)行的反應(yīng)。端水解核苷酸，舊鏈在合成一條新鏈時(shí)被置換。這導(dǎo)致單核苷酸和寡核苷酸從置換的DNA鏈的539。DNA聚合酶的這種特性被用來(lái)監(jiān)測(cè)反應(yīng)。端核酸酶檢測(cè)法中FRET DNA雙重探針是短的寡核苷酸，與擴(kuò)增DNA靶序列和修飾的339。端延長(zhǎng)。和539。報(bào)告熒光染料被放置在539。末端。核酸酶的活性，淬滅劑與報(bào)告基因分離，從而恢復(fù)報(bào)告基因的熒光性。每個(gè)探針在539。末端數(shù)的第七個(gè)核苷酸上。分子信標(biāo)：然而，以FRET為基礎(chǔ)的淬滅也能被使用。反應(yīng)完成后，反應(yīng)物加入固定有分子信標(biāo)的微量滴定孔中，借助讀取產(chǎn)生的熒光檢測(cè)產(chǎn)物。在這種情況下，分子信標(biāo)被直接加入到PCR混合物并且與擴(kuò)增反應(yīng)中新合成的DNA雜交?！26. 作為反義脫氧寡核苷酸的硫磷?；押塑账?↑TOP合理的藥物設(shè)計(jì)變得更加可行。合成的脫氧寡核苷酸(ODNs)已經(jīng)被Zameik和Stephenson提出作為一種新的潛在的治療方法，這種方法以一種合理的方式與信使RNA疾病關(guān)聯(lián)蛋白相互作用，并且特異的抑制它的合成。每個(gè)蛋白分子均遵循分子生物學(xué)的基本機(jī)制合成：一個(gè)基因(雙鏈DNA)攜帶一種特定蛋白質(zhì)的遺傳信息，被轉(zhuǎn)錄成作為信息攜帶者的單鏈mRNA，再以此作為模板在核糖體指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成(翻譯)。天然的寡核苷酸(DNA和RNA)不能夠達(dá)到作為反義藥物候選物的標(biāo)準(zhǔn)，不同的化學(xué)修飾將克服現(xiàn)存的障礙，它將被細(xì)胞吸收，抵抗核酸酶的降解和提高與mRNA的親和力。一旦進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，ODNs就必須抵抗核酸酶的降解。早期在組織培養(yǎng)中觀察到的ODNs的活性后曾認(rèn)為，這些理論上的障礙不值得擔(dān)心。mRNA親和力對(duì)于反義策略非常重要，它常常用解鏈溫度(Tm)所反映。加熱可將其退火解鏈成單鏈，導(dǎo)致其在260 nm處的紫外的吸收增加。這個(gè)吸收溫度曲線的中點(diǎn)被定義為T(mén)m，它反映的當(dāng)處于配對(duì)狀態(tài)的寡核苷酸鏈與處于單鏈狀態(tài)的寡核苷酸鏈達(dá)到平衡時(shí)的溫度。寡核苷酸的修飾主要發(fā)生在磷酸二脂的骨架。此外，骨架修飾能影響寡核苷酸鏈的其他性質(zhì)，如RNA親和力或細(xì)胞的吸收行為。 第一代的骨架修飾在硫磷酰中保留了磷原子。因此，相應(yīng)的寡核苷酸用于進(jìn)行體外或體內(nèi)試驗(yàn)，但不幸的是，它們都顯示對(duì)靶RNA的低親和力。這種有力的行為主要?dú)w因于生物的或化學(xué)的穩(wěn)定性，良好的藥物代謝動(dòng)力學(xué)特性包括細(xì)胞的攝取以及對(duì)于這類化合物RNase H提高了裂解mRNA的能力。 硫磷酰主要是通過(guò)兩種不同的方式合成的：一種是在二氧化碳中溶解硫元素，或者借助更新的辦法，即使用Beaucage試劑( H1,2Benzodithiol1one1,1二氧化物)硫化亞磷酸三脂。Beaucage試劑也硫磷酰合成產(chǎn)生兩種同分異構(gòu)體（R和S），即對(duì)于一個(gè)長(zhǎng)度為n的寡核苷酸，在每一個(gè)合成位點(diǎn)產(chǎn)生2n1個(gè)二倍體非對(duì)映異構(gòu)體。然而，幸運(yùn)的是，用任何標(biāo)準(zhǔn)S寡核苷酸制備同分異構(gòu)混合體不會(huì)出現(xiàn)影響生物學(xué)活性的寡核苷酸。 ↑TOP在STE緩沖液(10 mM TrisHCl , 50 nM NaCl, 1 mM EDTA)中溶解高濃度(110 OD260加熱到94癈然后緩慢冷卻至室溫。雙鏈DNA終產(chǎn)品是穩(wěn)定的,建議貯存于4癈或冷凍環(huán)境?！?0 / 2
試題試卷相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1