【正文】 型 : 1)放射性標記物 :用放射性同位素對核苷酸進行標記后的產物 .32P. 2)非放射性標記物 :無放射性污染 ,分辨力高 ,穩(wěn)定性好 ,但敏感性及特異性較差 .生物素標記的核苷酸 . 標記探針的方法 : 1)體內標記 2)體外標記 :化學法和酶促法 一、 Southern blot 用 DNA（或 RNA）探針檢測 DNA樣品 。用于研究基因表達 1)變性凝膠電泳 :單鏈 RNA易形成高級結構 ,使用變性劑有甲醛 ,乙二醛 ,尿素等 . 2)電泳過程中始終要有抑制 RNase作用 3)雜交前 ,干燥后的固相膜會由于變性劑的存在而干擾雜交靈敏度 ,先將膜泡在 TrisHis緩沖液中 95度 510分鐘 ,可洗脫與 RNA結合的甲醛 . 三、原位雜交 對應的菌斑或噬菌斑位置不變，可以直接找出陽性菌落。但當時在認識上和技術上存在兩個問題： 1. 當時沒有能把不同長度的核苷酸片斷分離開的技術。 第五節(jié) DNA序列分析 （ 1965年 Cornell大學的 . Holley等首次測定了75bp的酵母丙氨酸 tRNA全序列。 Sanger等 1977年發(fā)明。 （ 2）脫氧核糖的連接是以 3’?5’磷酸二脂鍵。 （ 4） 2’和 3’雙脫氧的 ddNTP會使復制反應終止。 ① 不能有 5’?3’和 3’?5’的外切酶活性； ② 與模板的親和力高，不會提前脫離模板。 （ 4）制備 2’和 3’雙脫氧的 ddNTP 需帶有放射性或熒光標記。 二、 MaxamGilbert化學修飾法 Walter Gilbert, 1980年 Nobel Prize化學獎 末端放射性標記 的 DNA片單鏈 長度最少差一個核苷 酸的 DNA鏈混合物 化學試劑處理 凝膠電泳 放射性自顯影 閱讀堿基順序 特定的堿基中 引入化學基團 DNA在被修飾的 核苷酸位置斷裂 1. 原理 堿基 特異 切割 方法 G 用 硫酸二甲脂 對 N7進行甲基化，修飾的 G在中性環(huán)境和高溫下會斷裂 A+G ,哌啶 甲酸可使嘌呤環(huán)的 N原子化，從而導致脫嘌呤，并因此削弱腺嘌呤和鳥嘌呤的糖苷鍵 C+T 肼 可打開嘧啶環(huán)，哌啶進一步從 T和 C處斷裂 C 在 ，可用肼除去胞嘧啶 2. 堿基特異的化學切割法 3. 測序過程 每組反應只針對特定的堿基，共有 4組反應，可分別顯示 G、 A+G、 C、 C+T的終止位置。 Sanger測序法讀出的序列是 新合成 的互補鏈序列。 用特定長度的具有所有可能堿基序列的寡核苷酸群體 ,與未知序列的 DNA片斷雜交 ,根據(jù)某些寡核苷酸探針形成的完全雙鏈推知目的DNA的堿基序列 . 1. 原理 （ 1）只有完全互補的 DNA序列才能雜交形 成完全的雙鏈分子。 （ 2）有個別不互補堿基時，雜交效率下降。 （ 4）用一段寡聚核苷酸（ 8mer）的 所有可能的堿基排列序列 作探針。 如： 8mer靶 DNA 同 65536中的 一種 探針完全雜交形成 完全互補 雙鏈。 5’AGCCTAGC3’ Target 3’TCGGATCG5’ Probe 假如探針序列已知，則可推知靶 DNA序列。 3’TCGGATCG5’ 3’CGGATCGA5’ 3’GGATCGAC5’ 3’GATCGACT5’ 3’ATCGACTT5’ 5’AGCCTAGCTGAA3’ 12mer target 8mer probe 假如知道能與之完全雜交的所有 5種探針序列，就可推知 12bp的靶 DNA序列。不同堿基組合的寡核苷酸小區(qū)排列在一起形成探針點陣 . 目前可以做出 65536 種 8mer探針芯片。 (2) （ 1）非放射性標記 1981年第一臺商業(yè)化生產的 DNA自動測序儀誕生。用激光能激發(fā)出 不同顏色的熒光。 （ 4）分析自動化 （ 3）讀片的自動化 激光探頭直接讀膠，實時閱讀。 電腦自動把熒光信號轉化成對應的堿基，并打印出 DNA序列。 2. 熒光標記引物的自動化測序 ① 分別用 4種熒光物標記 引物 ， ② 區(qū)分反應產物， ③混合 電泳， ④激光一次 讀膠， ⑤電腦 合成結果。 測序結果 第六節(jié) 基因定點突變技術 基因突變：基因組 DNA分子在結構上發(fā)生堿基 對中組成或排列順序的改變 ,并引起 個體表型的改變 ,而使生物體發(fā)生遺 傳變異 .分為 自發(fā)突變 和 誘發(fā)突變 . A 寡核苷酸介導的基因突變 : 1 寡核苷酸引物誘變技術 2 盒式誘導突變 1 寡核苷酸引物誘變技術 使用化學合成的含有突變堿基的寡核苷酸短片斷作為引物 ,啟動單鏈 M13噬菌體 DNA進行復制 ,隨后這段寡核苷酸引物成為新合成 DNA子鏈的一個組成部分 ,新生的子鏈便具有發(fā)生突變的堿基序列 . 原理 : 技術條件 : 載體 引物 2 盒式誘導突變 以各種雙鏈質粒 DNA為載體 ,采用人工合成的具有突變序列的寡核苷酸片斷置換待改造基因中兩個限制酶切點之間的序列 ,在轉化的大腸桿菌中形成數(shù)量眾多的突變體 .這些突變體就好象不同的盒式錄音磁帶 ,可隨時插入制備好的質粒中 . B PCR定點突變技術 應用 PCR技術在 DNA模板中預先確定的位置上引入單個或多個堿基的改變 . 1 引物 PCR定點誘變法 2 重組 PCR定點誘變法 第七節(jié) 酵母雙雜交系統(tǒng) Yeast Two Hybrid System (Interaction trap) 90年代，紐約大學的 S. Field等建立。 1. 結構域（ Domain）合作 一、酵母雙雜交系統(tǒng)的作用 例如： 啤酒酵母的半乳糖苷酶基因激活因子 GAL4: DNA binding domain Active domain N C 1147aa 768881aa 上游激活序列（ UAS） 轉錄機 GAL4效應基因 結合 結合 激活轉錄 只要 DNA binding domain（ DNABD）與 Active domain（ AD）靠近就能夠表現(xiàn)轉錄激活活性。 不能轉錄 3. 重組 Domain 用重組 DNA技術把這兩個 Domain分別與兩個不同的多肽連接。 通過效應基因是否被激活來檢查： 4. 觀察報告基因表達 上游激活序列（ UAS） 轉錄機 GAL4效應基因 蛋白 A DNA binding domain 轉錄激活 domain 蛋白 B GAL4的 DB domain與 AD Domain也不能靠近 ，所以仍然不能啟動效應基因的轉錄。 轉錄表達 （ 2）如果蛋白 A與蛋白 B能相互結合 雙雜交原理 X基因和 Y基因產物的相互結合，導致 reporter gene表達。 三、構建雙雜交體系的宿主菌 刪除基因組中的內源野生型 GAL4基因 使酵母菌只能利用 載體 表達的 GAL4蛋白。 HF7c等菌株。 GAL4的效應基因是 his3/lacZ/URA3。 1. 穿梭質粒（ shuttle plasmid） 五、構建雙雜交體系的穿梭質粒 既能在大腸桿菌中復制，又能在酵母菌中復制和表達的質粒。 靶基因按正確的讀碼結構和取向克隆在 GAL4的BD之后。 T: ADH1終止子。 P: ADHI啟動子。 篩選標志： LEU2 核定位信號是SV40的 T抗原的序列 六、酵母雙雜交的實驗過程 1. 把蛋白 A插入到 BD質粒上（ pGBT9） 2. 把蛋白 B插入到 AD質粒上（ pGAD424） 3. 兩種重組質粒共同轉化酵母菌（ HF7c） 報告基因： HIS（合成組氨酸） 4. 篩選觀察 （ 1）存活選擇 在缺少 亮氨酸（ LEU）和色氨酸（ TRP） 培養(yǎng)基上篩選 雙載體 轉化子。 Trp Leu 在缺少 組氨酸（ HIS）、亮氨酸（ LEU）和色氨酸（ TRP） 的培養(yǎng)基上篩選蛋白 A和蛋白 B能相互作用的雙載