【正文】 的 cDNA序列設(shè) 計(jì)熒光引物（表 1），選取 Ubiquitin 為內(nèi)參基因（ Fuentes et al.， 2022）。 μL 1）為 模板，在 StepOnePlus Realtime PCR system（ Applied Biosystems， CA）實(shí)時(shí)定量 PCR儀上，使用 SYBR174。 PCR 反應(yīng)體系： cDNA（ 50 ng L 1）各 μL ， SYBR Green Master Mix 10 μL ， ROX μL ，補(bǔ) ddH2O至 20 μL 。試驗(yàn)結(jié)果采用 2ΔΔCt 法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量 （ Livak amp。 表 1 類胡蘿卜素合成相關(guān)基因 RTPCR及 Realtime qPCR分析引物 Table 1 The primers of carotenoids biosynthesis genes for RTPCR and Realtime qPCR analysis 用途 Use 基因 Gene 正向引物（ 5′ – 3′ ） Forward primer（ 5′ – 3′ ） 反向引物（ 5′ – 3′ ） Reverse primer（ 5′ – 3′ ） 片段 /bp Size of the fragment RTPCR LCYE ACCGTAACTAAAACACACAT ATAACTTTCTGAACCGAGCA 1 682 LCYB1 GTCTGTATCTACCTCCAATC TAACACAATGAGTCAAAATC 1 795 CHXE GAGTTACCAAACTCCCAA CATCATCCCACATTCTATAC 1 712 CHXB1 TCTCACTCTCTTCTTCCACC CCTTTACGTTCTCATTCCTA 1 102 qPCR LCYE AAAGGAAACGCCAGAGAGC CGACTGAGGATAGAGAAGAACC 153 LCYB1 AGTGGGAATTGGCGGTACAG GCAGCTAGAGTTCTTGCTACCATATATC 72 CHXE TGGTTCCTTCGCTTCACAAG TTCCTCCATATTCACAGCAGAG 128 CHXB1 CTAAGGAAGTTGAGGATGTGGG TATGATCGGCTAGCTCTGGAAG 94 參照基因 Reference gene Ubiquitin ACCTCGTTCTGCGTCTCC GCCACTCTCATCCACCTTATAG 134 2516 園 藝 學(xué) 報(bào) 41卷 數(shù)據(jù)分析 采用 DPS軟件對(duì)各試材根、葉中類胡蘿卜素含量及各基因轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行鄧肯氏多重比較。 2 結(jié)果與分析 基因的 RTPCR RTPCR顯示所有材料均擴(kuò)增出了番茄紅素下游分支途徑中 LCYE 、 LCYB1 、 CHXE 和 CHXB1 的 cDNA片段（圖 1）。 LCYE 的 cDNA序列長(zhǎng)為 1 682 bp， Ws中存在 1個(gè)變異 位點(diǎn)； LCYB1 的 cDNA序列長(zhǎng)為 1 795 bp， Ws中存在 14個(gè)變 異位點(diǎn)； CHXE 的 cDNA序列長(zhǎng)為 1 712 bp， Ws中存在 8個(gè)變異位點(diǎn)； CHXB1 的 cDNA序列長(zhǎng)為 1 102 bp， Ws中存在 21個(gè)變異位點(diǎn)（表 2）。 Ws葉中的葉黃素和玉米黃質(zhì)含量顯著高于 Af。黃色 E52081根中檢測(cè)出了微量 β – 胡蘿卜素、葉黃素和玉米黃 質(zhì)，但其葉中類胡蘿卜素含量和組分更接近于 Ws。淺橘色 E35073根中 α – 胡 蘿卜素、 β – 胡蘿卜素含量與 E04041相當(dāng)，而其葉黃素含量只有 1；葉中的總類胡蘿卜素 含量最高，達(dá)到 1，其組分與 Af相似。 圖 2 試材根和葉中類胡蘿卜素含量比較 鄧肯氏顯著性檢驗(yàn)，小寫字母代表 。 Fig. 2 Comparison of carotenoid content in root and leaf Duncan’s multiple test ， different letter indicated the significant differences of level. The same below. 根和葉中類胡蘿卜素合成基因的表達(dá)量分析 LCYE 、 LCYB1 、 CHXE 和 CHXB1 在不同材料的根和葉中均有表達(dá)，但相對(duì)表達(dá)量差異顯著（圖 3）。 Af根中 4個(gè)基因均顯著高表達(dá)，其中 LCYE 為 Ws的 136倍，而 LCYB1 只有 ，葉中 LCYE 、 LCYB1 和 CHXB1 表達(dá)量相對(duì) Ws較低，而 CHXE 則是 Ws的 。 E52081根中 4個(gè)基因均顯著表達(dá)，但在葉中 LCYE 、 LCYB1 2518 園 藝 學(xué) 報(bào) 41卷 和 CHXB1 表達(dá)量最低，而 CHXE 介于 Ws和 Af之間。 E35073根中 CHXE 的表達(dá)量最高，為 Ws的 ， 而 CHXB1 表達(dá)量相對(duì)較低，只有 Ws的 ，但在葉中 4個(gè)基因的表達(dá)量與 Af較為相似。 表 3 葉和根中類胡卜素含量與基因相對(duì)表達(dá)量相關(guān)性分析 Table 3 Pearson correlation analysis between carotenoid content and gene expression in leaf and root 相關(guān)系數(shù) r 器官 Organ 組分 Component LCYE LCYB1 CHXE CHXB1 α – 胡蘿卜素 α carotene ** 根 Root β – 胡蘿卜素 β carotene ** 葉黃 素 Lutein 玉米黃質(zhì) Zeaxanthin – 總類胡蘿卜素 Total carotenoid ** α – 胡蘿卜素 α carotene – – 葉片 Leaf β – 胡蘿卜素 β carotene – – – – 葉黃素 Lutein – * – – – 玉米黃質(zhì) Zeaxanthin – 總類胡蘿卜素 Total carotenoid – * – – – 注： * 表示 ， ** 表示 。而且 根色遺傳極為復(fù)雜，已報(bào)道了多個(gè)有關(guān)的性狀位點(diǎn)，如 A （ α – 胡蘿卜素積累）， L1 和 L2 （番茄紅素 積累）， Io 、 O 和 y （木質(zhì)部顏色）， Y、 Y1 和 Y2 （ α – 胡蘿卜素、 β – 胡蘿卜素的分布和含量）， P1 和 P2 （花青素積累）等（ Buishand amp。 Simon， 1998； Simon， 2022），但這 些位點(diǎn)并沒有與類胡蘿卜素合成基因之間確立連鎖關(guān)系（ Santos amp。本研究中 BILs群體根色變異極為廣泛， E0904 E5208 E0404 E35073和 E2022為 5 個(gè)不同根色代表性的株系，其類胡蘿卜素組分和 含量截然不同，進(jìn)一步驗(yàn)證了胡蘿卜根色遺傳與類 胡蘿卜素合成之間存在不同的調(diào)控機(jī)制。 在不同基因型玉米中， LCYE 和 CHXB1 基因的多態(tài)性是造成籽粒 β – 胡蘿卜素含量差異的主要 原因（ Harjes et al.， 2022； Yan et al.， 2022）。在甘薯塊根中 ， LCYB 是 β – 胡蘿卜素合成途徑的關(guān)鍵酶基因（陳選 陽和張招娟， 2022）。本研究中亦發(fā)現(xiàn) LCYE 、 LCYB1 、 CHXE 和 CHXB1 在 Ws和 Af之間存在多個(gè) SNP位點(diǎn)變異，從根和葉中轉(zhuǎn)錄水平分析表明各個(gè)基因 均表現(xiàn)出其功能，但是否影響類胡蘿卜素合成效率還需要深入研究。 References Bai C， Twyman R M， Farr233