【正文】 C8） ③烷氨基 ④醚基 ⑤聚乙二醇 ? 疏水性吸附作用與配基的疏水性（疏水鏈長度）和配基密度成正比，一般配基修飾密度在 10～40 181。 ? 影響疏水性吸附的因素 ①離子強度及種類 ? 除離子強度外，離子的種類亦影響蛋白質的疏水性吸附。 ? HIC分離過程中主要利用硫酸銨、硫酸鈉和氯化鈉等鹽溶液為流動相，在略低于鹽析點的鹽濃度下進料，然后逐漸降低流動相離子強度進行洗脫分離。因此，這類陰離子稱為 離液離子 （ chaotropic ion）；相反鹽析作用強的高價陰離子（如 SO42－ ，HPO42－ 等）的作用正好相反，稱為 反離液離子 （ antichaotropic ion）。 ? 除離液離子外，乙二醇和丙三醇等含羥基的物質也具有影響水化的作用，降低蛋白質的疏水性吸附作用，經常用做洗脫促進劑。根據(jù)這一原理，難溶于水的膜蛋白質可添加一定量的表面活性劑使其溶解，利用 HIC法進行洗脫分離。蛋白質疏水部位的失水有利于疏水性吸附，而失水是吸熱過程，即疏水性吸附為吸熱過程。 ①可直接分離鹽析后的蛋白質 ②疏水性吸附劑種類多，選擇余地大 ③疏水性相互作用機理比較復雜 例如，鼠肝 細胞色素 C氧化酶可被 Octyl Sepharose完全吸附，而用 Decyl Sepharose為吸附劑時，吸附作用降低；在 Butyl Sepharose上部分吸附，而在 Phenyl Sepharose上則完全吸附。 金屬螯合色譜 Metal chelate chromatography ? 首先要制備金屬螯合介質：瓊脂糖環(huán)氧活化后與亞氨二乙酸鹽， HN:(CH2COO)2Me偶合，形成帶有雙羧甲基氨基的瓊脂糖。 ? 除了雙羧甲基氨基外，可以作為螯合形成基團的還有：水楊酸基， 8羥基喹啉基，氨基琥珀酸基等。 ? MCC分離時，必須使金屬離子對色譜填料凝膠的親和力大于對欲分離物質的配位親和力。 ? 常在 pH值為 6～ 8時蛋白質可被吸附，洗脫一般降低 pH值、增加離子強度或在緩沖液中加入螯合劑如 EDTA等方法進行。 － SH基與－ S－ S－ 能組成一組氧化 還原體系。葡聚糖凝膠通過 CNBr方法活化后，先后用谷胱甘肽及 2,2’吡啶基二硫化合物處理，得到谷胱甘肽型二硫鍵色譜填料。 ? 也可用交鏈聚丙烯酰胺作材料制得帶巰芳基的活性色譜填料。 ? 如果吸附后，柱上有剩余的未反應的巰基吡啶基基團，可用 pH值 （ 4 mmol/L）的二硫蘇糖醇， 。洗脫時，若使用還原力逐次增加的巰基化合物或者逐漸增加巰基化合物的濃度，都可以增加蛋白質的洗脫分辨率，提高選擇性。 ③再生過程 ? 洗脫后的色譜填料，需用 2,2’－吡啶基二硫化合物處理再生。 ? 二硫鍵色譜填料價格較貴，再生操作麻煩，目前尚未大規(guī)模的應用。 離子交換色譜 ? 離子交換色譜 （ ion exchange chromatography， IEC）利用離子交換劑為固定相，根據(jù)荷電溶質與離子交換劑之間靜電相互作用力的差別進行溶質分離的洗脫色譜法。 ? 對于蛋白質等兩性電解質，常數(shù) A和 B為 pH的函數(shù)。蛋白質為多價電解質，在 pH偏離等電點的溶液中凈電荷數(shù)常為兩位數(shù)以上，故 B值比較大。因此，如果采用離子強度不變的流動相進行恒定洗脫，兩種蛋白質的洗脫體積相差很大，甚至分配系數(shù)大的蛋白質很難洗脫。 ? 陽離子交換基為 CM（羧甲基，適用范圍 pH＞ 4）， P（膦酸基）和 SP（磺丙基）。 ? IEC操作很少采用恒定洗脫法，而多采用線性梯度洗脫法（ linear gradient elution）、逐次洗脫法（ stepwise elution）。 ? 但是， IEC的操作變量遠多于 GFC， 影響分離特性的因素非常復雜。 ? 載體 ? 載體是惰性、沒有吸附能力，能吸留較大量的固定相液體。但由于反相介質表面為強烈疏水性，并且流動相為低極性有機溶劑，生物活性大分子在RPC分離過程中容易變性失活。當固定相一定時，可通過調節(jié)流動相的組成調整溶質的分配系數(shù)。因此 RPC多采用降低流動相極性（水含量）的線性梯度洗脫法。其中利用 C18硅烷化試劑制備的反相介質最多，通稱 ODS（ Octadecyl silica），其次是 C8和 C4。 ? 反相介質性能穩(wěn)定，分離效率高，可分離肽、氨基酸、核酸、甾類、脂類、脂肪酸、糖類、植物堿等含有非極性基團的各種物質。 ? 凝膠過濾介質 1. 對凝膠過濾介質的要求 ① 親水性高 ， 表面惰性 ， 即介質與溶質之間不發(fā)生任何化學或物理相互作用； ② 穩(wěn)定性強 ， 在較寬的 pH和離子強度范圍以及化學試劑中保持穩(wěn)定 ， 使用壽命長 ， ③ 具有一定的孔徑分布范圍； ④ 機械強度高，允許較高的操作壓力 （ 流速 ） 。 Sephadex G是利用葡聚糖 （ 右旋糖酐 ） 交聯(lián)制備的，交聯(lián)劑一般采用環(huán)氧氯丙烷 。 ② 瓊脂糖系（ Sepharose、 BioGel A ） ? 瓊脂糖凝膠 Sepharose是另一種較常使用的凝膠過濾介質，機械強度較低。 ? BioGel A為 Bio Rad產品。 ⑤ Superdex ⑥ Superose ⑦ TSK gel Toyopearl HW ? 聚乙烯醇系 ⑧ Biobeads ? 為苯乙烯與二乙烯苯的共聚物、用于非水體系。 PW系列機械強度更高，適用于高壓液相色譜。 ? 凝膠特性參數(shù) ① 排阻極限 （ exclusion limit） ? 凝膠過濾介質的排阻極限是指不能擴散到凝膠網(wǎng)絡內部的最小分子的相對分子質量。 ② 分級范圍 （ fractionation range） ? 即能為凝膠阻滯并且相互之間可以得到分離的溶質的相對分子質量范圍。 ③ 溶脹率 ? 溶脹后每克干凝膠所吸收的水分的百分數(shù)，Sephadex G50的溶脹率為 500％土 30％。粒徑越小， HETP越小，分離效率越高。軟凝膠粒徑較大，一般為 50～ 150 181。m 。m ， 而 Superose和 TSK Toyopearl HW系列可小到 20～ 40 181。m 。Sephadex G50的床體積為 9～ 11 cm3/g干膠?？障扼w積可用相對分子質量大于排阻極限的溶質測定，一般使用平均相對分子質量為 2021 kD的水溶性藍色葡聚糖 （ blue dextran） 。 ? 分配系數(shù) Kd＝ （ Ve－ Vo） /Vi 0≤ Kd≤1 ? MW與 Kd的關系 Kd ＝ a－ blogMW ? GFC的應用及特點 ① 分離純化 ? GFC可用于相對分子 質量從幾百到， 106 數(shù)量級的物質的分離 純化。 色譜柱： 10 300， Superose 6 洗脫液： ／ L磷酸鹽 ＋ ／ L NaCl（ ） 流量： ／ min 2. IgA二聚體 ②脫鹽 ? GFC在生物分離領域的另一主要用途是生物大分子溶液的脫鹽，以及除去其中的低相對分子質量物質。 ? 不過， GFC僅對球形分子的測量精度較高，對分子形狀為棒狀的物質，測量值將小于實際值。 ? 與其他色譜法相比， GFC的不足之處在于： ① 僅根據(jù)溶質之間分子量的差別進行分離，選擇性低，料液處理量??； ② 經 GFC洗脫展開后產品被稀釋。 高速逆流色譜 ? 高速逆流色譜（ High speed counter current chromatography， HSCCC）是一種無固相載體的連續(xù)液液分配色譜技術，在重力與離心力場的作用下，其固定相被保留于分離柱內，從而避免了固相載體與樣品發(fā)生化學反應變性或不可逆吸附。 TBE 300V型高速逆流色譜示意圖 徑向色譜分離法 ? 徑向色譜柱的結構及原理如圖所示。 ? 由于徑向色譜柱反壓降較低 ， 樣品出峰較快 ，對設備的要求較低 ， 通常的低壓色譜系統(tǒng)就可滿足要求 。 ? 當色譜柱體積相差不大時 （ 徑向柱大 25％ ） ，徑向柱的流速為軸向柱的 3～ ，處理量為軸向柱的 3倍。它能夠分離多組分混合物并且設備結構簡單、操作方便，故很有工業(yè)應用前景。連續(xù)加料柱由兩個同心圓筒緊夾在底板上而組成，兩同心圓筒間的間距為 1cm，空間內用適當?shù)臉渲蚰z膠充填，在圓柱間隙下的底盤四周有一系列小孔通向接收器。洗脫液 沿圓周方向，連續(xù)向下沖洗， 而待分離的化合物只在床層 頂端區(qū)域輸入。