雙波長(zhǎng)法快速測(cè)定蛋白質(zhì)含量-在線瀏覽
2024-10-03 21:59本頁(yè)面
【正文】 ,雙蒸水作為溶劑。傳統(tǒng)考馬斯亮蘭法利用考馬斯亮蘭 蛋白 W/ V) ,最后加蒸餾水至 200ml ,此染料于 4℃避光結(jié)合物最大吸收波長(zhǎng) 595nm時(shí)的吸收度 A來(lái)反映可存放 6個(gè)月。蛋白質(zhì)的濃度 ,而忽略了游離考馬斯亮蘭染料在此 1. 3 吸收光譜測(cè)定 :將染料 1∶稀釋并過(guò)濾 ,在干波長(zhǎng)下也有一定的吸收度。酶標(biāo)儀可一次檢測(cè)大量標(biāo)但不超過(guò) 30min。因此考馬斯1. 2 染料的配制 :將 100mg考馬斯亮蘭溶解在靈5540分光光度計(jì)廠 , 752C)在 460～ 700nm波長(zhǎng)內(nèi) ,每10nm檢測(cè)樣品的透光率 ,換算成吸收度 ,根據(jù)吸收度 波長(zhǎng)繪制吸收光譜圖。用酶標(biāo)儀 (Bio Rad ,model550)代替紫外 可見(jiàn)分光光度計(jì)作為檢測(cè)儀 ,酶標(biāo)檢測(cè)板作為反應(yīng)池 ,檢測(cè)特定波長(zhǎng)下不同蛋白濃度產(chǎn)生的吸收度。根據(jù)吸收度 波長(zhǎng)繪制考馬斯亮蘭 蛋白質(zhì)結(jié)合物吸收光譜 (圖 la) 。ACTA ACADEMIA E MEDICINA E SU ZHOU 2000 。2. 2 蛋白質(zhì)檢測(cè)的線性范圍 :為了適合酶標(biāo)儀濾光片的檢測(cè) ,以 595nm和 450nm作為檢測(cè)波長(zhǎng) ,將 BSA從 1mg倍比稀釋至 240pg/ ml ,以檢測(cè)樣品在各濃度 C時(shí)的吸收度。由圖 2可知 ,A595和 A595/ A450在一定范圍內(nèi)和蛋白質(zhì)濃度成正比關(guān)系 ,A450和蛋白質(zhì)濃度無(wú)正相關(guān)。為了明確 A595/ A450雙波長(zhǎng)法檢測(cè)范圍 ,通過(guò)局部放大作圖 3。20 (1)41從圖 3a、3b可知 ,A595/ A450雙波長(zhǎng)法最高檢測(cè)上限的蛋白質(zhì)濃度為 32. 25μg/ ml ,最低檢測(cè)下限為0. 122μg/ ml 。2. 3 標(biāo)準(zhǔn)曲線 :在檢測(cè)限范圍內(nèi) ,以蛋白質(zhì)濃度 C為橫坐標(biāo) ,吸收度 A為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。A595 C直線關(guān)系為 y = 0. 0258x +0. 4859 ,相關(guān)系數(shù) r2 = 0. 9951。的人為影響因素。雖然單波長(zhǎng)和雙波長(zhǎng)法之間線性相關(guān)系數(shù)差別不大 ,但雙波長(zhǎng)測(cè)定法比單波長(zhǎng)測(cè)定法具有更寬線性測(cè)量范圍。在測(cè)定過(guò)程中隨著蛋白質(zhì)濃度的增加 ,游離考馬斯亮蘭染料逐漸減少 ,因此在蛋白質(zhì)濃度發(fā)生改變時(shí) ,不但染料 蛋白質(zhì)結(jié)合物在 595nm的品僅 100μl或更少 ,而且一次可檢測(cè)大量的標(biāo)本 ,過(guò)程自動(dòng)化程
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