真核表達系統(tǒng)的選擇和高效表達策略-在線瀏覽
2025-03-24 04:33本頁面
【正文】 成素、干擾素、生長激素、單克隆抗體等 . 煙草、馬鈴薯、大豆、香蕉、萵苣、羽扇豆等作為生物反應器生產(chǎn)口服疫苗 ,也得到了人們的廣泛關注。 在研究成功的轉(zhuǎn)基因植物藥用蛋白中 , 80%是由農(nóng)桿菌介導形成的轉(zhuǎn)基因植物表達系統(tǒng)生產(chǎn)。同一種重組蛋白在植物中的生產(chǎn)成本是微生物發(fā)酵體系的 2% 10% ,是哺乳動物細胞生產(chǎn)的 %。 鹽藻是極其耐鹽的，可以在 0. 05 5 mol/ l氯化鈉的極端環(huán)境中生存。 鹽藻作為新型的真核生物反應器，除了具有轉(zhuǎn)錄和翻譯后的加工能力外，還具有經(jīng)濟廉價、簡單有效、安全可靠等特點 。 外源基因在鹽藻中的表達主要是集中在 cat、 bar、 gus和 egfp等報告基因上 ,大多為瞬時表達。 鹽藻作為一種新型的生物反應器 ,目前還不能真正生產(chǎn)外源性物質(zhì)。 巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng) ? 畢赤酵母能夠成功表達出多種外源蛋白 ,是由于畢赤酵母具有以下獨特的優(yōu)點 : ? (1) 能夠快速繁殖和進行高密度培養(yǎng) 。 ? (3) 可以對外源蛋白進行類似真核的加工折疊和翻譯后修 ? 飾 ,產(chǎn)物從而具有天然蛋白的活性 。 ? (5) 培養(yǎng)條件簡單 ,成本低。 巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng) ? 巴斯德畢赤酵母菌株： ? 一 般 用 于 外 源 基 因 表 達 的 Pichia pastoris 菌株有Y211430 ,M2C10023 , GS115 , X33， KM71 , SMD1168等 . 根據(jù)利用甲醇的能力 , 可將巴斯德畢赤酵母分為 3 型 : ① Mut + 型為甲醇快利用型 , 此型畢赤酵母具有完整的 AOX1 和 AOX2 基因 , 絕大多數(shù)畢赤酵母為 Mut + 表型 。 ③ Mut型 (如 M2G10023) , 此型畢赤酵母 AOX1 及 AOX2 基因均被敲除 ,為甲醇不利用型 。 一般說來 ,蛋白胞內(nèi)表達時 ,優(yōu)先考慮用 Muts 表型 ,對于分泌表達 ,Mut+和 Muts都可使用 。 Pichia pastoris表達載體 ? 畢赤酵母表達載體包括自我復制型的游離載體和整合型載體 ， 但以整合型載體為主 。 胞內(nèi)表達的載體有 pPIC pPIC3K、 pHILD pPICZA、 pPICZAB和 pPICZAC等； 分泌表達的載體有 pPIC pPIC9K、 pACO81 pPICZαA（ B、 C）和 pHILS1等 。 巴斯德畢赤酵母表達載體的結(jié)構(gòu)與功能 畢赤酵母表達載體的啟動子 ? Pichia pastoris 含有兩個基因編碼醇氧化酶 :AOX1和 AOX2 ,二者序列有 92 %同源性 ,但是 AOX1表達水平高于 AOX2。 以甲醇為碳源生長時 ,約 5%的 mRNA由 AOX1 基因轉(zhuǎn)錄。Vassilen 利用 GAP 啟動子表達乙肝表面抗原獲 ? 得高表達 , Genzyme 也利用 GAP 啟動子表達人幾丁質(zhì)酶 ,不僅獲得高表達 ,而且還可以避免蛋白酶水解。 畢赤酵母表達載體上的選擇標記 ? 選擇標記一般為對應于營養(yǎng)缺陷型受體的野生型基因 , 常用 his4 , 也可用來源于釀酒酵母的 arg4基因和 suc2基因 . kanr基因和Shbler 基因（ Zeocin抗性基因）也能夠作為細菌和酵母菌的選擇標記，并且攜帶這兩個標記的表達載體較其他表達載體更易于篩選。 目前可供選擇的酵母信號肽有 ?2交配因子的前導肽序列、酸性磷酸酶信號肽和蔗糖酶信號肽等 。 酶切割位點周圍氨基酸序列及外源蛋白的 3 級結(jié)構(gòu)可以影響信號肽的加工效率。當前常用的巴斯德畢赤酵母表達載體可分為 2 類 . ① 胞內(nèi)表達載體。如 p HIL2S1 ,p PIC9 K,p PICZα,p GAPZα。許多蛋白的正確構(gòu)象和翻譯后加工 (如糖基化等 ) 都是在分泌途中完成的。 轉(zhuǎn)化時 ,載體 DNA 必須切成線狀才能與染色體進行同源重組 ,將整個載體連同外源基因整入宿主染色體 . 通常有以下幾種整合方式 : ① 雙位點互換。② AOX1單位點互換。產(chǎn)生的表型是 His+Mut+。發(fā)生在染色體 His 位點和表達質(zhì)粒的 His 位點 ,使得 1 個或多個表達
教學課件相關推薦
鄂ICP備17016276號-1