【正文】 汞、甲醛、過氧化氫、高錳酸鉀、來蘇兒、漂白粉、次氯酸鈉、抗菌素、酒精化學(xué)藥品處理。 濕熱滅菌（培養(yǎng)基） ? 培養(yǎng)基在制備后的 24h內(nèi)完成滅菌工序。在 o． 1MPa的壓力下，鍋內(nèi)溫度達(dá) 121℃ 。 ? 注意完全排除鍋內(nèi)空氣，使鍋內(nèi)全部是水蒸氣，滅菌才能徹底。常用方法是：關(guān)閉放氣閥，通電后，待壓力上升到O． 05MPa時(shí)，打開放氣閥，放出空氣，待壓力表指針歸零后，再關(guān)閉放氣閥。 ? 對(duì)高壓滅菌后不變質(zhì)的物品，如無菌水、栽培介質(zhì)、接種用具，可以延長滅菌時(shí)間或提高壓力。 ? 對(duì)于一些布制品，如實(shí)驗(yàn)服、口罩等也可用高壓滅菌。 ? 高壓滅菌前后的培養(yǎng)基，其 pH值下降 。在高壓滅菌前用堿調(diào)高pH值至預(yù)定值的則相反。環(huán)境 pH值的變化大于 的生理影響。在 8%20%蔗糖范圍內(nèi)，高壓滅菌后的培養(yǎng)基約升高0． 43倍。培養(yǎng)基值小于 ，其水解量更多，培養(yǎng)基中添加 %活性炭時(shí)，高壓下蔗糖水解大大增強(qiáng)，添加 1%活性炭，蔗糖水解率可達(dá) 5%。 ? (2)設(shè)計(jì)培養(yǎng)基配方時(shí)盡量采用效果類似的穩(wěn)定試劑并準(zhǔn)確掌握劑量。 ? (3)配制培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)注意成分的適當(dāng)分組與加入的順序。 ? (4)注意高壓滅菌后培養(yǎng)基 pH值的變化及回復(fù)動(dòng)態(tài)。而 96h后又回降至 右。 灼燒滅菌 （ 用于無菌操作的器械 ） ? 在無菌操作時(shí)，把鑷子、剪子、解剖刀等浸入 95%的酒精中，使用之前取出在酒精燈火焰卜灼燒火菌。操作中可采用 250或 500ml的廣口瓶，放入 95%的酒精，以便插入工具。由于在干熱條件下，細(xì)菌的營養(yǎng)細(xì)胞的抗熱性大為提高，接近芽抱的抗熱水平，通常采用 170℃ 持續(xù)90min來滅菌。包扎可用耐高溫的塑料。烘箱內(nèi)放置的物品的數(shù)量不宜過多，以免妨礙熱對(duì)流和穿透，到指定時(shí)間斷電后，待充分冷涼，才能打開烘箱，以免因驟冷而使器皿破裂。 過濾滅菌（不耐熱的物質(zhì) ） ? 一些生長調(diào)節(jié)劑，如赤霉素、玉米素、脫落酸和某些維生素是不耐熱的，不能用高壓滅菌處理，通常采用過濾滅菌方法。使用前對(duì)其高壓滅菌，將濾膜裝在注射器的靠針管處，將待過濾的液體裝入注射器，推壓注射器活塞桿，溶液壓出濾膜，從針管壓出的溶液就是無菌溶液。紫外線滅菌是利用輻射因子滅菌，細(xì)菌吸收紫外線后，蛋白質(zhì)和核酸發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，引起細(xì)菌的染色體變異，造成死亡。 ? (2)熏蒸滅菌 用加熱焚燒、氧化等方法，使化學(xué)藥劑變?yōu)闅怏w狀態(tài)擴(kuò)散到空氣中，以殺死空氣和物體表面的微生物。 ? 常用熏蒸劑是甲醛，熏蒸時(shí)，房間關(guān)閉緊密，按 5— 8ml／ m3用量，將甲醛置于廣口容器中，加 5g/m3高錳酸鉀氧化揮發(fā)。冰醋酸也可進(jìn)行加熱熏蒸，但效果不如甲醛。一般說來，溫度越高，作用時(shí)間越長，殺菌效果越好。還有消毒劑的濃度一般是濃度越大，殺菌能力越強(qiáng)，但石炭酸和酒精例外。如桌面、墻面、雙手、植物材料表面等，可用 70%的酒精反復(fù)涂擦滅菌， l%2%的來蘇兒溶液以及 %— 1%的新潔爾滅也可以。這些污染源一旦帶人培養(yǎng)基，便會(huì)造成培養(yǎng)基污染。 ? 第一步 ，將采來的植物材料除去不用的部分，將需要的部分仔細(xì)洗干凈，如用適當(dāng)?shù)乃⒆拥人⑾础Ｖ米詠硭堫^下流水沖洗幾分鐘至數(shù)小時(shí)，沖洗時(shí)間視材料清潔程度而宜。流水沖洗在污染嚴(yán)重時(shí)特別有用。洗衣粉可除去輕度附著在植物表面的污物，除去脂質(zhì)性的物質(zhì)，便于滅菌液的直接接觸。 ? 第二步 是對(duì)材料的表面浸潤滅菌。用 70%酒精浸 10～ 30s。有一些特殊的材料，如果實(shí)、花蕾、包有苞片、苞葉等的孕穗，多層鱗片的休眠芽等等，以及主要取用內(nèi)部的材料，則可只用 70%酒精處理稍長的時(shí)間。 第三步 是用滅菌劑處理。 滅菌劑 使用濃度 (%) 持續(xù)時(shí)間（ min） 去除的難易 效果 次氯酸鈣 9~10 5~30 易 很好 次氯酸鈉 2 5~30 易 很好 氯化汞 ~1 5~8 較難 最好 抗菌素 4~50mg/L 30~60 中 較好 常用滅菌劑使用濃度及效果比較表 ? 上述滅菌劑應(yīng)在使用前臨時(shí)配制，氯化汞可短期內(nèi)貯用。 ? 滅菌時(shí)，把瀝干的植物材料轉(zhuǎn)放到燒杯或其他器皿中，記好時(shí)間，倒人消毒溶液，不時(shí)用玻璃棒輕輕攪動(dòng)，以促進(jìn)材料各部分與消毒溶液充分接觸，驅(qū)除氣泡，使消毒徹底。滅菌時(shí)間是從倒人消毒液開始，至倒入無菌水時(shí)為止。滅菌液要充分浸沒材料，寧可多用些滅菌液，切勿勉強(qiáng)在一個(gè)體積偏小的容器中使用很多材料滅菌。但吐溫加人后對(duì)材料的傷害也在增加，應(yīng)注意吐溫的用量和滅菌時(shí)間，一般加入滅菌液的 %，即在 100ml加入 15滴。無菌水涮洗作用是免除消毒劑殺傷植物細(xì)胞的副作用。接種室內(nèi)保持定期用 1%— 3%的高錳酸鉀溶液對(duì)設(shè)備、墻壁、地板等進(jìn)行擦洗。無菌操作可按以下步驟進(jìn)行： ? (1)在接種 4h前用甲醛熏蒸接種室，并打開其內(nèi)紫外燈進(jìn)行滅菌； ? (2)在接種前 20min，打開超凈工作臺(tái)的風(fēng)機(jī)以及臺(tái)上的紫外燈； ? (3)接種員先洗凈雙手，在緩沖間換好專用實(shí)驗(yàn)服，并換穿拖鞋等； ? (4)上工作臺(tái)后，用酒精棉球擦拭雙手，特別是指甲處。 ? 若連續(xù)接種，每 5天要大強(qiáng)度滅菌一次。 ? (2)材料吸干后，一手拿鑷子，一手拿剪子或解剖刀，對(duì)材料進(jìn)行適當(dāng)?shù)那懈睢Ｎ⑶o尖要?jiǎng)兂芍缓?l— 2片幼葉的莖尖大小等。 ? (3)用灼燒消毒過的器械將切割好的外植體插植或放置到培養(yǎng)基上。若用棉塞蓋口，可先在管口外面灼燒，去掉棉塞，再燒管口里面。若是葉片直接附在培養(yǎng)基上，以放 1— 3塊為宜。放置材料數(shù)量現(xiàn)在傾向少放，通過統(tǒng)計(jì)認(rèn)為：對(duì)外植體每次接種以一支試管放一枚組塊為宜，這樣可以節(jié)約培養(yǎng)基和人力，一旦培養(yǎng)物污染可以拋棄，接完種后，將管口在火焰上再灼燒數(shù)秒鐘。 第二節(jié) 培養(yǎng)和馴化 ? 指把培養(yǎng)材料放在培養(yǎng)室 (有光照、溫度條件 )里，使之生長，分裂和分化形成愈傷組織或進(jìn)一步分化成再生植株的過程。是現(xiàn)在最常用的方法。 ? (2)液體培養(yǎng)法 即用不加固化劑的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)植物材料的方法。 2．培養(yǎng)步驟 ? (1)初代培養(yǎng) 初代培養(yǎng)旨在獲得無菌材料和無性繁殖系。初代培養(yǎng)時(shí)，常用誘導(dǎo)或分化培養(yǎng)基，即培養(yǎng)基中含有較多的細(xì)胞分裂素和少量的生長素。根據(jù)初代培養(yǎng)時(shí)發(fā)育的方向可分為： 1)頂芽和腋芽的發(fā)育 ? 采用外源的細(xì)胞分裂素，可促使具有頂芽或沒有腋芽的休眠側(cè)芽啟動(dòng)生長，從而形成 一個(gè)微型的多枝多芽的小灌木叢狀的結(jié)構(gòu)。然后將一部分嫩莖轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上，就能得到可種植到土壤中去的完整的小植株。這種繁殖方式也稱作微型扦插，它不經(jīng)過發(fā)生愈傷組織而再生，所以是最能使無性系后代保持原品種特性的一種繁殖方式。 ? 莖尖培養(yǎng)可看作是這方面較為特殊的一種方式。在實(shí)際操作中，采用包括莖尖分生組織在內(nèi)的一些組織來培養(yǎng)，這樣便保證了操作方便以及容易成活。但特殊情況下也會(huì)生出不定芽，形成芽叢。然后，經(jīng)再分化，即由這些分生組織形成器官原基，它在構(gòu)成器官的縱軸上表現(xiàn)出單向的極性 (這與胚狀體不同 )。 ? 另一種方式是從器官中直接產(chǎn)生不定芽，有些植物具有從各個(gè)器官上長出不定芽的能力如矮牽牛、福祿考、懸鉤子等。許多種類的外植體表面幾乎全部為不定芽所覆蓋。許多單子葉植物儲(chǔ)藏器官能強(qiáng)烈地發(fā)生不定芽，用臼合鱗片的切塊就可大量形成不定鱗莖。用靠培養(yǎng)不定芽得到的培養(yǎng)物，一般采用芽叢進(jìn)行繁殖，如非洲菊、草莓等。但它是由體細(xì)胞發(fā)生的。 (2)繼代培養(yǎng) ? 在初代培養(yǎng)的基礎(chǔ)上所獲得的芽、苗、胚狀體和原球莖等，數(shù)量都還不多，它們需要進(jìn)一步增殖，使之越來越多，從而發(fā)揮快速繁殖的優(yōu)勢。旨在繁殖出相當(dāng)數(shù)量的無根苗，最后能達(dá)到邊繁殖邊生根的目的。如果以 2株苗為基礎(chǔ)，那么經(jīng) 10代將生成 210株苗。切割莖段常用于有伸長的莖梢、莖節(jié)較明顯的培養(yǎng)物。培養(yǎng)基常是 MS0基本培養(yǎng)基；分離芽叢適于由愈傷組織生出的芽叢。若芽叢的芽較小，可先切成芽叢小塊，放人 MS0培養(yǎng)基中，待到稍大時(shí)，再分離開來繼續(xù)培養(yǎng)。但在達(dá)到相當(dāng)?shù)臄?shù)量之后，則應(yīng)考慮使其中一部分轉(zhuǎn)入生根階段。 培養(yǎng)過程中常出現(xiàn)的問題及解決方法 初代培養(yǎng)外植體的褐變 ? 外植體褐變是指在接種后，其表面開始褐變，有時(shí)甚至?xí)拐麄€(gè)培養(yǎng)基褐變的現(xiàn)象。在褐變過程中，會(huì)產(chǎn)生醌類物質(zhì)，它們多呈棕褐色，當(dāng)擴(kuò)散到培養(yǎng)基后，就會(huì)抑制其他酶的活性，從而影響所接種外植體的培養(yǎng)。由于多酚氧化酶活性上的差異，因此，有些花卉品種的外植體在接種后較容易褐變，而有些花卉品種的外植體在接種后不容易褐變。 ? ② 生理狀態(tài) 由于外植體的生理狀態(tài)不同，所以在接種后褐變程度也有所不同。一般來說，幼嫩的組織在接種后褐變程度并不明顯，而老熟的組織在接種后褐變程度較為嚴(yán)重。 ? ④ 培養(yǎng)條件不當(dāng) 如果光照過強(qiáng)、溫度過高、培養(yǎng)時(shí)間過長等，均可使多酚氧化酶的活性提高，從而加速被培養(yǎng)的外植體的褐變程度。 ? ② 合適的培養(yǎng)條件 無機(jī)鹽成分、植物生長物質(zhì)水平、適宜溫度、及時(shí)繼代培養(yǎng)均可以減輕材料的褐變現(xiàn)象。另外，使用 %%的活性炭對(duì)防止褐變也有較為明顯的效果。 繼代培養(yǎng)時(shí)材料的玻璃化 ? 實(shí)踐表明，當(dāng)植物材料不斷地進(jìn)行離體繁殖時(shí)，有些培養(yǎng)物的嫩莖、葉片往往會(huì)呈半透明水漬狀，這種現(xiàn)象通常稱為玻璃化。玻璃化為試管苗的生理失調(diào)癥。在不同的種類、品種間，試管苗的玻璃化程度也有所差異。在培養(yǎng)基中添加少量聚乙烯醇、脫落酸等物質(zhì)，能夠在一定程度上減輕玻璃化的現(xiàn)象發(fā)生。這種情況主要是由于培養(yǎng)容器中空氣濕度過高，透氣性較差造成的，其具體解決的方法為： ? ① 增加培養(yǎng)基中的溶質(zhì)水平，以降低培養(yǎng)基的水勢； ? ② 減少培養(yǎng)基中含氮化合物的用量； ? ③ 增加光照； ? ④ 增加容器通風(fēng)，最好進(jìn)行 CO2施肥，這對(duì)減輕試管苗玻璃化的現(xiàn)象有明顯的作用； ? ⑤ 降低培養(yǎng)溫度，進(jìn)行變溫培養(yǎng)，有助于減輕試管苗玻璃化的現(xiàn)象發(fā)生； ? ⑥ 降低培養(yǎng)基中細(xì)胞分裂素含量，可以考慮加入適量脫落酸。 若不能及時(shí)將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基上去 ， 就會(huì)使久不轉(zhuǎn)移的苗子發(fā)黃老化 ， 或因過分擁擠而使無效苗增多造成拋棄浪費(fèi) 。 生根培養(yǎng)可采用 1／ 2或者 1/4MS培養(yǎng)基 ， 全部去掉細(xì)胞分裂素 ， 并加入適量的生長素 (NAA、 IBA等 )。 上述三種方法均能誘導(dǎo)新梢生根 ， 但前二種方法對(duì)新生根的生長發(fā)育則更為有利 。其原因是當(dāng)根原始體形成后較高濃度生長素的繼續(xù)存在 ， 則不利于幼根的生長發(fā)育 。 ? 另外也可采用下列方法就可生根：①延長在增殖培養(yǎng)基中的培養(yǎng)時(shí)間；②有意降低一些增殖倍率，減少細(xì)胞分裂素的用量 (即將增殖與生根合并為一步 )；③切割粗壯的嫩枝在營養(yǎng)缽中直接生根，此方法則沒有生根階段。 ? 另外少數(shù)植物生根比較困難時(shí)，則需要在培養(yǎng)基中放置濾紙橋，使其略高于液面，靠濾紙的吸水性供應(yīng)水和營養(yǎng)，從而誘發(fā)生根。 但因經(jīng)胚狀體途徑發(fā)育的苗數(shù)特別多 ， 并且個(gè)體較小 ， 所以也常需要一個(gè)低濃度或沒有植物激素的培養(yǎng)基培養(yǎng)的階段 ， 以便壯苗生根 。 通常不同植物的適宜馴化溫度不同 。 實(shí)踐證明植物生長的溫度過高不但會(huì)牽涉到蒸騰加強(qiáng) 。 溫度過低使幼苗生長遲緩 ， 或不易成活 。 ? 移植到試管外的植物苗光強(qiáng)度應(yīng)比移植前培養(yǎng)有所提高，并可適應(yīng)強(qiáng)度較高的漫射光， (約 4000h左右 )，以維持光合作用所需光照強(qiáng)度。 二、試管苗移栽馴化 ? 試管苗移栽是組織培養(yǎng)過程的重要環(huán)節(jié) ， 這個(gè)工作環(huán)節(jié)做不好 ， 就會(huì)造成前功盡棄 。 ? 試管苗由于是在無菌、有營養(yǎng)供給、適宜光照和溫度近 100%的相對(duì)濕度環(huán)境條件下生長的，因此，在生理、形態(tài)等方面都與自然條件生長的正常小苗有著很大的差異。 ? 從葉片上看，試管苗的角質(zhì)層不發(fā)達(dá)，葉片通常沒有表皮毛，或僅有較少表皮毛，甚至葉片上出現(xiàn)了大量的水孔，而且，氣孔的數(shù)量、大小也往往超過普通苗。因此，為了改善試管苗的上述不良生理、形態(tài)特點(diǎn)，則必須經(jīng)過與外界相適應(yīng)的馴化處理另外，對(duì)栽培馴化基質(zhì)要進(jìn)行滅菌，因?yàn)樵嚬苊缭跓o菌的環(huán)境中生長，對(duì)外界細(xì)菌、真菌的抵御能力極差。 ，通常采取的措施有：對(duì)外界要增加濕度、減弱光照；對(duì)試管內(nèi)要通透氣體、增施二氧化碳肥料、逐步降低空氣濕度等。 為了增加粘著力和一定的肥力可配合草炭土或腐殖土 。 也可用砂子：草炭土或腐殖土為