【正文】 5’ 3’ CCTAC(N)13 ｂ）能識別簡并順序的，如： AvaI AvaI 5’ CPyCGPuG3’ CCCGGG。 CCCGAG。 2. 酶切位點與識別位點不一致，切點常在識別位點的一側(cè)， 1 20nt。 4. 產(chǎn)生粘性末端可以是 15個核苷酸。 基因工程中的工具酶 Restriction Maps (a) 基因工程中的工具酶 Restriction Maps (b) 基因工程中的工具酶 CH3 CH3 CH3 RE RE RE RE RE RE RE RE RE RE RE CH3 CH3 CH3 與載體相連 甲基 化酶 人工 接頭 RE 用于基因組文庫的建立 用于 cDNA的連接 RE RE RE 基因工程中的工具酶 二、 DNA聚合酶 （一）、 DNA聚合酶 I（ polⅠ ） 1. 的 DNA聚合酶系統(tǒng) Pol Ⅰ 參與 DNA修復(fù) , 具 3’ →5 ’和 5’ →3 ’外切酶活性 pol Ⅱ 同上 具 3’ →5 ’外切酶活性 pol Ⅲ 參與 DNA復(fù)制 , 具 3’ →5 ’和 5’ →3 ’外切酶活性 2. polⅠ 的特點 1）具兩種外切酶活性和 DNA聚合酶活性，在蛋白酶作用下，該酶分裂成兩個大小不同的片段，其中小片段具 5’ →3 ’外切酶活性，大片段具 3’ →5 ’外切酶活性 (大片段亦稱為 Klenow片段 , polIK) 2） 聚合酶活性， 5’ →3 ’ , 要求 3’ OH引物和模板 DNA，其延續(xù)性受反應(yīng)條件的影響 3） 外切酶活性 基因工程中的工具酶 3. 用途 1） 除去 3’ 端突起的單鏈 DNA（在無 dNTP時） 2） 補齊 5’ 突起端 3） 合成第二條 cDNA 4） 切口移位制備探針 其中用途 2) 和 3)常用大片段 基因工程中的工具酶 三、連接酶 （一）、 T4 DNA連接酶 1. 特點： 只連接 ds DNA分子，要求 3’ 羥基和 5’ 磷酸基 2. 用途： 1) 相同或相容粘性末端的連接 2) 平整末端的相連 DNA平端來源：限制酶作用結(jié)果 。平端的連接比粘性末端的連接要困難得多，所需的酶量也多 基因工程中的工具酶 5’ AAGCTT3’ 5’ AOH PAGCTT3’ PAGCTT AOH 3’ TTCGAA5’ 3’ TTCGAP HOA5’ HOA TTCGAP 退火 5’ AHOPAGCT T AHOPAGCT T3’ 3’ T TCGAPOHA T TCGAPOHA5’ 或 5’ AHOPAGCT T AHOPAGCT T3’ 3’ T TCGAPOHA T TCGAPOHA5’ T4 DNA連接酶 5’ AAGCTT AAGCTT3’ 3’ TTCGAA TTCGAA5’ 或 5’ AAGCTT AAGCTT3’ 3’ TTCGAA TTCGAA5’ T4 DNA連接酶的連接反應(yīng) (兩種插入方向 ) + The polymerase chain reaction (PCR)： to amplify a sequence of DNA using a pair of primers each plementary to one end of the the DNA target sequence. 1985年，美國 Cetus 公司和加利福尼亞大學(xué)聯(lián)合創(chuàng)建了一種核酸體外擴增技術(shù)。 編碼抗菌素抗性基因的質(zhì)粒叫 R質(zhì)粒。 質(zhì)粒 DNA分子可以持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外地游離狀態(tài)，但在一定地條件下又會可逆地整合到寄主染色體上，隨著染色體地復(fù)制而復(fù)制，并通過細(xì)胞分裂傳遞到后代。 環(huán)形雙鏈的質(zhì)粒 DNA分子具有三種不同的構(gòu)型：共價閉合環(huán)狀 DNA（ cccDNA），開環(huán) DNA（ ocDNA），線性 DNA（ cDNA），具有不同的電泳遷移率，可在瓊脂糖凝膠電泳中分開 。 根據(jù)每個寄主細(xì)胞中質(zhì)?？截悢?shù)的多少，把質(zhì)粒分為嚴(yán)緊型復(fù)制質(zhì)粒（拷貝數(shù)少，為 15個）與松弛型復(fù)制質(zhì)粒（拷貝數(shù)多，可達 10200份拷貝）。 質(zhì)粒的不親和性，有時也稱為不相容性，是指在沒有選擇壓力的情況下，兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒，不能夠在同一個寄主細(xì)胞系中穩(wěn)定地共存的現(xiàn)象。這樣的兩種質(zhì)粒稱為不親和質(zhì)粒。如 pUC系列載體。 Vectors （二）載體特點 至少有一個復(fù)制起點，因而至少可在一種生物體中自主復(fù)制。 至少應(yīng)有一個遺傳標(biāo)記基因，以指示載體或重組 DNA分子是否進入宿主細(xì)胞。 ?注：前三個特點必不可少 。 * 這種指示也可以是選擇性的（如 TcS），也可以是非選擇性的（如 TcS， lacZα），絕大多數(shù)為后者。當(dāng)充任第一作用時，最好是選擇性標(biāo)記基因；當(dāng)完成第二作用時，目前多采用非選擇性的 — 檢測性標(biāo)記基因。 標(biāo)記基因的種類 1） 抗性標(biāo)記基因 （可直接用于選擇轉(zhuǎn)化子） 主要是 抗生素抗性基因 : Ampr ， Tetr ， Cmlr， Kanr， Strr 2） 生化標(biāo)記基因 其表達產(chǎn)物可催化某些易檢測的生化反應(yīng)，如 lacZ 常用的遺傳標(biāo)記基因及其作用機制 1) 四環(huán)素抗性基因 （ Tetr ， Tcr） Tetracycline 可結(jié)合在核糖體 30s亞基中的一種蛋白質(zhì)分子上，抑制核糖體的轉(zhuǎn)位過程。 2) 氨芐青霉素抗性基因 （ Ampr ， Apr） Ampicillin可抑制細(xì)菌細(xì)胞