【正文】 5．基因擴(kuò)增（ gene amplification） 6. 基因甲基化的改變 1. 轉(zhuǎn)導(dǎo)（ transduction） 在漫長的生物進(jìn)化過程中，現(xiàn)在的逆轉(zhuǎn)錄病毒的祖先在感染正常細(xì)胞的同時(shí)，通過復(fù)雜的遺傳學(xué)重組和突變，將正常細(xì)胞的細(xì)胞癌基因整合到其基因組中，并使之改變成活化的病毒癌基因。 2. 點(diǎn)突變（ point mutation） 美國的 Weinberg， Wigler和 Cooper等實(shí)驗(yàn)室于 1983 年分別從不同的膀胱癌細(xì)胞系中分離 DNA，用以轉(zhuǎn)染 NIH／ 3T3細(xì)胞系，可使之發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。 在人類正常細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了其對應(yīng)物(cHaras), Barbacid與 Weinberg的研究組分別發(fā)現(xiàn)，膀胱癌中的活化癌基因與其對應(yīng)的正常癌基因之間只有一個(gè)堿基對的差別，即 (cHaras)基因的第一個(gè)外顯子 (exon)所編碼的多肽鏈氨基端第 12位密碼子上發(fā)生了有突變，其鳥瞟呤被胸腺嘧啶所取代，使其編碼的甘氨酸被氨酸所取代。 3. 插入突變（ insertional mutation) 逆轉(zhuǎn)錄病毒中的慢病毒本身不含有癌基因，但能以前病毒的形式插入到宿主細(xì)胞癌基因的鄰近而將其激活。新生雛雞在感染 ALV后 6～ 12月才產(chǎn)生腫瘤，在癌前期觀察到法氏囊中大量細(xì)胞受到病毒感染，而且 ALV的 DNA插入到不同細(xì)胞基因組的不同位點(diǎn)。在腫瘤細(xì)胞中 ALV的 DNA可發(fā)生部分缺失，但至少項(xiàng)保存一部分。 ALV前病毒的長末端序列（ LTR）經(jīng)常缺失或失活，所以可能其 3`端 LTR為轉(zhuǎn)錄提供強(qiáng)有力的啟動(dòng)子，從而產(chǎn)生大量與前病毒 DNA相連的 cmyc序列。這兩種情況也可加強(qiáng)c－ mvc的轉(zhuǎn)錄，但其作用機(jī)理尚不太清楚。 由此可見，在誘發(fā)的腫瘤中至少涉及兩個(gè)癌基因的活化。 現(xiàn)有資料證明，這些部位分別含有免疫球蛋白輕鏈 Igκ , Ig λ 和以及重鏈 IgH基因。 還有資料指出．易位的 cmyc的 3`端與免疫球蛋白基因的 3`端相連。 5．基因擴(kuò)增（ gene amplification） 在人的慢粒白血病細(xì)胞系（ HL60）中，發(fā)現(xiàn)了 cmyc的擴(kuò)增，表現(xiàn)為雙微體（ dounle minutes， DMs）和均染區(qū)（ Homogeneous staning region,HSR）的形成，可通過原位雜交法加以證實(shí)。有報(bào)道在胃癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了 cHaras癌基因的低甲基化，而低甲基化可導(dǎo)致 cHaras癌基因的過度表達(dá)。關(guān)于抑癌基因存在的概念由來以久，人們最初從腫瘤細(xì)胞染色體特定部位的缺失推測它的存在。當(dāng)用正常細(xì)胞同腫瘤細(xì)胞雜交，或?qū)⒛骋粭l正常細(xì)胞染色體導(dǎo)人腫瘤細(xì)胞中時(shí)，觀察到腫瘤細(xì)胞的惡性表型受到抑制，從而推測在正常細(xì)胞染色體上存在著抑癌基因。 1986~l987年國際上有 3個(gè)實(shí)驗(yàn)室成功地分離到第一個(gè)抑癌基因 —— Rb基因的 cDNA克?。畯亩挂职┗蜓芯窟M(jìn)入了分子生物學(xué)時(shí)代。目前對抑癌基因尚無明確分類，但近年來由于抑癌基因數(shù)量的增多，而其中一些基因在功能上與傳統(tǒng)的抑癌基因有很大的不同，為便于了解起見，現(xiàn)將其分成兩大類： 表現(xiàn)為喪失功能的抑癌基因（傳統(tǒng)的抑癌基因） Rb基因 FAP 相關(guān)的抑癌基因 p53基因 p21Cipl基因 p73基因 p27Kipl NF1基因 FHIT基因 WT1基因 PTEN ErbA基因 Kreyl基因 DPC4基因 INK4基因 參與 DNA修復(fù)抑癌基因（新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因） 錯(cuò)配修復(fù)基因 BRCA1基因 ATM基因 一 、表現(xiàn)為喪失功能的抑癌基因 1. Rb基因 視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤 (retinoblastoma)是嬰幼兒眼惡性腫瘤中最常見的一種。 Rb基因在遺傳學(xué)上是隱性的，即必須兩個(gè)等位基因同時(shí)缺失形成所謂的缺失純合子，或一個(gè)等位基因缺失而另一基因突變而失活，才能導(dǎo)致基因功能的喪失。某些視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤患者的紅細(xì)胞脂酶 D活性只有正常人的一半，而在瘤細(xì)胞中則其活性為 0。 同時(shí)提示，在體細(xì)胞中可能只有一個(gè)等位基因缺失，而另一個(gè)則是正常的，其基因型可能是 13q ／ l3RB。 脂酶 D的研究不僅為闡明腫瘤發(fā)生的機(jī)理提供了有力的依據(jù)，更重要的是，脂酶 D基因與 Rb基因的緊密連鎖，為 Rb基因的分離鋪平了道路。 經(jīng)過反復(fù)篩選，獲得了一個(gè)與脂酶 D相鄰的，編碼 46kb mRNA基因，定名為視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤易感基因，簡稱 Rb基因。 以后各國學(xué)者對 Rb基因的結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)行了大量的研究： 現(xiàn)已明確， Rb基因的基因組 DNA總長為200kb，有 27個(gè)外顯子，轉(zhuǎn)錄為 mRNA，編碼含 928氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，其分子量為110~114kD。 未磷酸化型 Rb蛋白可能是抑制細(xì)胞增殖的活性型。 Rb蛋白還可以對細(xì)胞內(nèi) 轉(zhuǎn)錄因子、生長因子 起調(diào)控作用： 研究資料表明，在正常細(xì)胞內(nèi)可能存在著Rb蛋白的靶蛋白。一旦 Rb蛋白同SV40或腺病毒基因組的相應(yīng)部位結(jié)合，或在位點(diǎn)發(fā)生了點(diǎn)突變，就可能喪失其生理功能。 另外， Rb基因可抑制細(xì)胞內(nèi) 癌基因的表達(dá) 。 Rb蛋白還可通過同 cmyc， Nmyc，erbB2／ neu等 癌基因產(chǎn)物 相結(jié)合來調(diào)節(jié)細(xì) 胞的增殖和分化。 隨后克隆到了 p53基因，并證明它能轉(zhuǎn)化鼠類細(xì)胞，而且發(fā)現(xiàn)在惡性轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中， p53基因的表達(dá)增高。 隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)了一些矛盾的現(xiàn)象。 按照 Knudson關(guān)于抑癌基因作用模式推測，丟失的染色體片段中可能存在著抑癌基因。 這種等位／突變的模式表明， p33基因很可能象 Rb基因那樣，是一個(gè)抑癌基因。 根據(jù)現(xiàn)有資料，基因全長 16～ 20 kb，由 11個(gè)外顯子組成．產(chǎn)生長 25kb的 mRNA，編碼含393個(gè)氨基酸殘基的蛋白，分子量為 53 kD。基因突變大多數(shù)發(fā)生于外顯子，與上述保守區(qū)基本相符。正常細(xì)胞的兩個(gè)等位基因是雜合的，因而顯示不同的帶型。如其中某一個(gè)單鏈發(fā)生了突變，就可使單鏈的構(gòu)型發(fā)生變化，結(jié)果使其電泳速度發(fā)生變化，導(dǎo)致額外電泳帶的出現(xiàn)； ? ③ 直接 DNA測序： 由于突變經(jīng)常發(fā)生于第 5～ 8外顯子，故可設(shè)計(jì)這 4個(gè)外顯子上下游的引物進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（ polymerase chain reaction, PCR）擴(kuò)增，然后分別進(jìn)行 DNA測序（ DNA sequencing）。 正常野生型 p53（ wtp53）基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物不穩(wěn)定，半衰期僅 20分鐘，而突變型 p53（ mp53）的半衰期則延長至 ～ 7小時(shí)，所以如用原位雜交或免疫組化方法來檢測，則不能檢測到 wtp53。 只有 wtp53蛋白才具有抑癌活性， mp53蛋白則不僅喪失了抑癌活性，而且還能與 wtp53蛋白結(jié)合使其喪失抑癌功能。 這一點(diǎn)與必須兩個(gè)等位基因同時(shí)失活不同，說明 p53基因突變的遺傳型是顯性的。 wtp53基因的功能是多方面的，主要有以下幾面： ①轉(zhuǎn)錄因子活性 ② wtp53信號(hào)區(qū)的功能 ① 轉(zhuǎn)錄因子活性 p53蛋白是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，可通過轉(zhuǎn)錄活化區(qū)與通用轉(zhuǎn)錄因子（ multisubunit transcription factor,TF11D）結(jié)合并相互作用。 與 TF11D中的 TAF結(jié)合， TF11D再通過 TBP與其下游基因啟動(dòng)子中的 TATA box結(jié)合而發(fā)揮作用。 MDM2通過與 wtp53轉(zhuǎn)錄活性區(qū)相互作用而起到抑制 mp53活性的作用。 wtp53基因 借助于 SH3區(qū)的結(jié)合活性，把它同信息傳遞通道直接聯(lián)系起來，激活某些靶基因如 p21／ WAFI／ cip1的轉(zhuǎn)錄活性。 總之， wtp53正是通過其轉(zhuǎn)錄活性和信號(hào)傳遞功能而發(fā)揮其抑癌功能的，主要表現(xiàn)為調(diào)節(jié) 細(xì)胞周期 和誘導(dǎo) 細(xì)胞凋亡 (將在其他章節(jié)中詳細(xì)加以敘述 )。 Kaghad等于 1997年在利用針對 IRSl結(jié)合區(qū)的寡核苷酸探針與 COS細(xì)胞的 cDNA文庫進(jìn)行雜交分析中，檢出一假陽性克隆它與 IRSl結(jié)合區(qū)無任何同源性，卻與 p53基因的大部分保守序列均同源。 利用熒光原位雜交技術(shù)將基因定位于 lp36區(qū)。 p73基因由 13個(gè)外顯子和 12個(gè)內(nèi)含子組成， 其表達(dá)產(chǎn)物 p73蛋白與 p53蛋白有同源性： p73蛋白和 p53蛋白一樣具有 4個(gè)主要的功能區(qū)，其氨基端的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域與 p53 29％同源，中部的 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與 p53 63％同源， p53的 6個(gè)突變熱點(diǎn) p73也完全保守，寡聚結(jié)構(gòu)域有38％同源，而羧基端則未檢出明顯同源。 p73 β 除了最后 5個(gè)氨基酸殘基為其所特有外，其余均與 p73 α 的相應(yīng)序列完全相同。 利用酵母菌雜交系統(tǒng)研究蛋白各種剪切變異體之間相互作用時(shí)，發(fā)現(xiàn) p73β 蛋白形成同源二聚體的能力很強(qiáng)，類似于 p53，而 p73 α 則很弱。 這些結(jié)果表明， p73蛋白各種剪切變異體能形成同型或異型相互作用，而且提示這些作用有可能發(fā)生于體內(nèi)，以便協(xié)調(diào)整個(gè) p53p73系統(tǒng)的功能。 p73還能激活部分 p53的靶基因，但對絕大多數(shù) p53靶基因其作用則明顯弱于 p53基因。但有趣的是，對某些靶基因如 1433 a和 PIG7的誘導(dǎo)水平卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于 p53。 另外，不同型 p73蛋白的生物功能強(qiáng)弱不同，其中以 p73β 的功能最強(qiáng)。反之， p53 /小鼠易患腫瘤，卻無明顯的發(fā)有異常，這提示有一更原始的基因能夠替代 p53而完成小鼠某階段的發(fā)育，而這個(gè)基因是否就是 p73呢？ ③ 三種經(jīng)典的病毒癌蛋白（ SV40大 T抗原、腺病毒 EIB55kD和 HPV E6）均能作用于 p53并使之失活，從而使宿主細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，卻不能與 p73蛋白相結(jié)合。 4．與家族性腺瘤樣息肉病 (familial adenomatous polyposis, FAP） 相關(guān)的抑癌基因 FAP過去通常稱之為家族性結(jié)腸息肉病（ familial polyposis coli,FPC），是一種常染色體顯性遺傳病。 其基因產(chǎn)物定位于細(xì)胞質(zhì)， APC不僅同F(xiàn)AP有關(guān)，而且同散發(fā)性結(jié)腸癌、肺癌等腫瘤有關(guān)。 在染色體上與 APC相鄰，同 G蛋白偶聯(lián)的乙酰膽堿蕈毒堿受體的一小片段有很高的同源性。 ? DCC（ deleted in colorectal carcinoma）基因 定位于 18號(hào)染色體長臂（ ），基因全長約 370 kb其 mRNA長 10～ 12 kb，編碼含 750個(gè)氨基酸殘基的蛋白，分子量為 190 kD。 DCC蛋白與細(xì)胞同細(xì)胞及細(xì)胞同基質(zhì)之間相互關(guān)系有關(guān)。