遺傳工程和轉(zhuǎn)基因技術(shù)-在線瀏覽
2024-10-22 21:43本頁面
【正文】 7啟動子 來自于 T7噬菌體，有該啟動子并在 T7 RNA聚合酶驅(qū)動下表達(dá)外源基因的大腸桿菌質(zhì)粒稱為 pET表達(dá)載體家族。 pET表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外原蛋白必須使用特殊的大腸桿菌受體菌，如 BL21和 HNS174。 pET表達(dá)系統(tǒng)是一個基因表達(dá)的級聯(lián)反應(yīng)， IPTG首先誘導(dǎo) PlacUV5啟動子表達(dá) T7 RNA聚合酶， T7 RNA聚合酶再選擇性的結(jié)合 T7啟動子啟動外源基因的轉(zhuǎn)錄。 ，帶有 pUC質(zhì)粒的復(fù)制起點和 ampr基因，可以在大腸桿菌內(nèi)擴增和選擇重組轉(zhuǎn)化子，同時載有 SV40的復(fù)制起點和新霉素抗性基因，可以在表達(dá) SV40T抗原的細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并選擇重組轉(zhuǎn)化子。 此融合基因能夠表達(dá)目的蛋白和組氨酸，故通過標(biāo)記組氨酸可分離純化目的融合蛋白，組氨酸可以作為檢測融合蛋白的標(biāo)簽。 組織纖溶酶原激活物克隆表達(dá) ? tPA 纖溶酶原 → 纖溶酶 → 水解纖維蛋白 （可用于血凝塊的溶解，治療血栓梗塞性疾?。? ? tPA基因（信號肽 和 tPA CDNA） 表達(dá)載體 → 重組載體 → 轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞 → 用 HAT培養(yǎng)基選擇出穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細(xì)胞 → 細(xì)胞表達(dá)低水平的 tPA → Mtx（氨甲蝶呤）篩選 → 細(xì)胞表達(dá)高水平的 tPA → 細(xì)胞在發(fā)酵器培養(yǎng) → tPA分泌 tPA于培養(yǎng)液中。限制性內(nèi)切酶是一類具有嚴(yán)格識別位點，并在識別位點內(nèi)或附近切割雙鏈 DNA 的脫氧核糖核酸酶。 影響限制性內(nèi)切酶活性的因素包括 DNA的純度、緩沖液、溫度及酶本身。 由于在限制性內(nèi)切酶消化反應(yīng)中，甘油濃度超過 5％會抑制內(nèi)切酶活性，因此在 20μl 反應(yīng)體系中，甘油濃度應(yīng)少于 1μl 。緩沖液一般分為高、中、低鹽３種。 在需進行雙酶切反應(yīng)時，可采用以下不同的方法進行。如果相差甚遠(yuǎn)，則必須如下進行：①在第１個酶酶解反應(yīng)完畢后，采用乙醇沉淀，回收已線性化的 DNA， 再建立第２個酶切體系，繼續(xù)酶解。③如果兩個酶的反應(yīng)條件只是溫度上的差別，可以先加一種酶進行酶解，然后加入另一種酶在相應(yīng)的溫度下酶解。典型的反應(yīng)是 20μl 體積中含 ～1μgDNA 。 (2)加入 10 緩沖液 2μl 。 (5)稍離心，混合。 (7)取出后電泳分析鑒定是否酶解 。 2. 為保持限制酶的活性，將酶從低溫冰箱取出后立即置于預(yù)先準(zhǔn)備的 冰浴中，操作應(yīng)迅速，用后立即放回低溫水箱中。 4. 若要取用多種酶， 每種酶必須單獨使用吸頭，避免交叉污染。 UNIQ10質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒 DNA 本試劑盒的核心是 UNIQ10柱。 DNA與 UNIQ1 0 的結(jié)合需要一定的離子強度。含質(zhì)粒的上清液加入到 UNIQ1 0拄中，經(jīng)簡單的洗滌步驟除去非特異性結(jié)合的雜 質(zhì)。 質(zhì)粒 DNA提取 操作步驟 1． 將過夜培養(yǎng)的 1～ 2ml細(xì)菌 12， 000rpm離心 15秒，徹 底去除上清。在執(zhí)行步驟 5后，將 上清分批加入到 UNlQ10柱中，重復(fù)步驟 6，直至處理完所有 樣品。 3．加入 200 μl Solution II ，立即溫和混勻 (傾斜 45度角， 順一個方向，慢慢旋轉(zhuǎn)離心管 )，使細(xì)菌裂解，室溫放 置 2分鐘。 4．加入 350 μl SoIution llI 立即上下顛倒 5～ 10次，使之 充分中和，室溫放置 2分鐘。 6．將步驟 5中上清轉(zhuǎn)移到套放于 ml收集管內(nèi)的 UNIQ10柱中， 8， 000rpm室溫離心 15秒。 7. 棄收集管中的廢液，將 UNlQ10柱放入同一支收集管 中， 吸取 500 μl Wash Solution 至 UNIQ1O柱， 10， 000rpm室溫離心 30秒。 9． 棄收集管中的廢液，將 UNIQ10柱放入同一支收集管 中， 1O， 000rpm室溫離心 30秒以徹底去除 Wash SOlutiOn。離心管中的溶液即為所抽提的質(zhì)粒 DNA。 DNA體外連接 利用 DNA連接酶把目的 DNA片段和載體 DNA連接在一起， 成為一個新的重組分子，這就是基因工程中常說的 DNA體外連接。由于質(zhì)粒載體也必須用同樣的酶消化，亦得兩個相同的粘性末端，因此在連接反應(yīng)中，外目的基因片段和質(zhì)粒載體 DNA均可能發(fā)生自身環(huán)化， 而且正反兩種連接方向都有。 用兩種不同的限制酶進行消化可以產(chǎn)生這樣的末端。 由產(chǎn)生平末端的限制酶或核酸外切酶消化產(chǎn)生，或由 DNA聚合酶 Klenow片段補平 339。 成功的連接反應(yīng)需純凈的目的 DNA片段，相對應(yīng)的末端濃度。目的基因比例太多， 易產(chǎn)生基因自連后插入載體的多聚體，根據(jù)插入片段和載體的分子量大小、計算連接反應(yīng)體系中需要加入的各 DNA 片段含量。 載體與目的 DNA片段的連接 1. 在 EP管中建立連接反應(yīng)體系 線性化目的基因 （ ） 4 μl 載體 DNA （經(jīng) CIP處理） 1 μl 10 連接緩沖液 1 μl T4DNA連接酶 1 μl H2O 至 10 μl 2. 16℃ 水浴 12 ～ 6h。 平粘端連接 （如二端均為 EcoRI粘端）。 T4連接酶連接匹配的粘末端（另一端不匹配，沒有連接）。 5μlTE ，加 1μl 連接緩沖液， 1μl 連接酶， ddH2O 13μl 作 用 16 ～ 20h。 。轉(zhuǎn)化所用的受體細(xì)胞一般是限制－修飾系統(tǒng)缺陷變異株，即不含限性內(nèi)切酶和甲基化酶。 進入受體細(xì)胞的 DNA分子通過復(fù)制和表達(dá)實現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使受體細(xì)胞具有了新的遺傳性狀。 試劑及儀器 1. LB液體培養(yǎng)基 2.
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