【正文】 毒原種。（7）應(yīng)用在細(xì)胞水平上進(jìn)行突變體選擇的技術(shù)，可以在一定程度上使高等植物的育種程序微生物化，從而大大提高選擇效率，節(jié)省時間和土地面積，并且不受季節(jié)的限制。（9）通過用人工種皮包被體細(xì)胞胚制造人工種子，為某些稀有和珍貴物種的繁殖提供了一種高效的手段。一、細(xì)胞全能性概述，這些基因在適宜的外界條件下按照某種特定的程序先后表達(dá)最終分化形成一個完整的植株稱為細(xì)胞全能（totipotency)細(xì)胞全能性的相對性；不是所有基因型的所有細(xì)胞在任何條件下都具有良好的反應(yīng)；：一個植物細(xì)胞所具有的產(chǎn)生完整植物個體的潛在能力。屬G0期細(xì)胞。離體外植體細(xì)胞實現(xiàn)全能性，首先經(jīng)歷脫分化使其恢復(fù)分生狀態(tài)，然后進(jìn)行再分化。：1）以植物體細(xì)胞為材料，可以獲得二倍體植株可以開花國、結(jié)果。3）以植物單細(xì)胞的原生質(zhì)體或融合的原生質(zhì)體為材料，可以獲得不同倍性的植株，甚至自然中不存在的遠(yuǎn)緣雜種。 脫分化 再分化切取形成層→無菌接種 → 誘導(dǎo)愈傷組織的形成 → 試管苗的形成→培養(yǎng)室→移栽：從外植體脫分化形成愈傷組織大致可分為三個時期：啟動期 （誘導(dǎo)期）、分裂期和形成期。：1）無性繁殖并大大量擴(kuò)繁被培養(yǎng)的植物2）為細(xì)胞懸浮培養(yǎng)盒次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)與利用、原生質(zhì)體培養(yǎng)和細(xì)胞融合提供易于操作的起始材料3）為植物體細(xì)胞無性系變異、細(xì)胞突變體篩選創(chuàng)造適宜的體系和基礎(chǔ)4）為外源基因的遺傳轉(zhuǎn)化提供便于保存和利用的操作對象5）為種質(zhì)資源的保存提供新的形式6）為離體研究植物組織和細(xì)胞分裂、分化、代謝和狀態(tài)的轉(zhuǎn)變創(chuàng)造適宜的材料和體系：外植體的類型與生理狀態(tài)：選擇細(xì)胞分化水平較低或含低分化細(xì)胞的器官或組織；選擇幼嫩、分生能力強(qiáng)、不含發(fā)育抑制物或其含量較低的器官或組織作為誘導(dǎo)愈傷組織的外植體。培養(yǎng)基的選擇：培養(yǎng)基的類型；激素含量等其他培養(yǎng)條件：溫度（2528或2830 、光照（光照周期1216h；光照強(qiáng)度15002000 lx）愈傷組織的類型：顏色：奶黃色；白色有光澤；淡綠色；黃色或褐色是否具有胚性：胚性愈傷組織和非胚性愈傷組織（Induction）: 誘導(dǎo)期是細(xì)胞準(zhǔn)備分裂的時期，是愈傷組織形成起點。細(xì)胞內(nèi)的合成代謝迅速進(jìn)行，但是細(xì)胞的大小仍然和外植體時一樣，沒有多大改變。二、多聚核糖體的不斷增加，到有絲分裂前RNA的含量增加300﹪；三、蛋白質(zhì)合成加快，分裂前細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的總量增加200﹪；四、各種與分裂有關(guān)的酶活性大加強(qiáng)。在回復(fù)變化時，細(xì)胞通過脫分化的啟動期而進(jìn)入分裂，并開始形成愈傷組織。另外細(xì)胞數(shù)目增加，體積變??；細(xì)胞核和核仁增到最大，RNA含量升高等。進(jìn)入形成期后，表層細(xì)胞分裂逐漸停止，內(nèi)部深處細(xì)胞開始分裂，組織內(nèi)部形成瘤狀的擬分生組織。愈傷組織的特征：細(xì)胞分裂快，結(jié)構(gòu)疏散；缺少有組織的結(jié)構(gòu)；顏色淺而透明。:。:多酚氧化酶是植物體內(nèi)普遍存在的一類末端氧化酶，它催化酚類化合物形成醌和水，醌再經(jīng)非酶促聚合形成深色物質(zhì)，對植物體材料產(chǎn)生毒害作用。外植體的部位及生理狀態(tài)。4培養(yǎng)基的成分和培養(yǎng)條件。選擇適宜的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件添加褐變抑制劑和吸附劑。減輕酚類化合物的毒害。原因復(fù)雜沒有定論。提高糖的含量或加入滲透劑，降低培養(yǎng)基中滲透勢，減少植物材料可獲得的水分。 細(xì)胞再分化1. 細(xì)胞水平的再分化。官水平的再分化（又稱器官發(fā)生）2. 影響細(xì)胞再分化因素:關(guān)鍵：維管組織的分化（生長素、蔗糖濃度、細(xì)胞分裂素和赤霉素、物理因子）。: 在離體的培養(yǎng)條件下，植物的組織或細(xì)胞團(tuán)（愈傷組織）分化形成不定根、不定芽等器官的過程。容易產(chǎn)生多倍體細(xì)胞。3）生長素和細(xì)胞分裂素同時處理，分化頻率提高。4)生長素/細(xì)胞分裂素：比值高時，有利于根分化； 比值低時，有利于芽分化，抑制根形成； 比值適中時，促進(jìn)愈傷組織生長。在細(xì)胞脫分化過程中，啟動細(xì)胞分裂形成愈傷組織，以2,4D最為有效。②細(xì)胞分裂素在離體培養(yǎng)條件下，既可誘導(dǎo)細(xì)胞分裂，又可調(diào)節(jié)細(xì)胞分化。滲透壓調(diào)節(jié)物質(zhì)及其應(yīng)用：糖對滲透壓起決定作用，其次甘露醇、鹽類也可影響滲透壓。7. 培養(yǎng)基的酸堿度：調(diào)節(jié)培養(yǎng)基酸堿度的意義：離體條件下，培養(yǎng)基酸堿度與植物細(xì)胞脫分化、再分化和器官發(fā)生有著密切的關(guān)系。調(diào)節(jié)方法如下：pH測定計測定、pH值試紙比色測定，用1mol/LHCl或KOH進(jìn)行調(diào)節(jié)。光強(qiáng) 10001500lx，光周期1216h，近紫外和藍(lán)紫光促進(jìn)芽的發(fā)生，紅光促進(jìn)生根。2. 體細(xì)胞胚胎發(fā)生概念與特點概念：離體培養(yǎng)下沒有經(jīng)過受精過程，但經(jīng)過了胚胎發(fā)育過程所形成的胚的類似物（不管培養(yǎng)的細(xì)胞是體細(xì)胞還是生殖細(xì)胞），統(tǒng)稱為體細(xì)胞胚或胚狀體。體細(xì)胞胚或花粉胚都是指在植物組織培養(yǎng)中起源于一個非合子細(xì)胞，經(jīng)過胚胎發(fā)生和胚胎發(fā)育過程形成的胚狀結(jié)構(gòu)，包括以下幾點含義： 體細(xì)胞胚是組織培養(yǎng)的產(chǎn)物，區(qū)別于無融合生殖的胚，只限于在組織培養(yǎng)范圍使用； 體細(xì)胞胚起源于非合子細(xì)胞，區(qū)別于合子胚； 體細(xì)胞胚的形成經(jīng)歷胚胎發(fā)育過程，區(qū)別于組織培養(yǎng)的器官發(fā)生中芽與根的分化。 存在生理隔離。 卵形態(tài)發(fā)生的特性 : **植物組織培養(yǎng)過程中植物體細(xì)胞胚胎途徑可歸納為兩類：直接途徑和間接途徑。:1)途徑 直接途徑：從外植體某個部位直接誘導(dǎo)分化出體細(xì)胞胚間接途徑：首先形成愈傷組織，其后在愈傷組織表面分化形成體細(xì)胞胚。一是體細(xì)胞胚具有雙極性（doublepolarity），二是遺傳的穩(wěn)定性：胚狀體起源于單細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)，在產(chǎn)生和發(fā)育過程中一旦形成即通過了分化過程，結(jié)構(gòu)即穩(wěn)定，細(xì)胞變異的頻率低，成苗率高，遺傳穩(wěn)定性好。:合子胚在發(fā)育初期具有明顯的胚柄，而體細(xì)胞胚一般沒有真正的胚柄只有類似胚柄的結(jié)構(gòu)。合子胚的子葉是相當(dāng)規(guī)范的，可以作為分類的依據(jù)，而體細(xì)胞胚的子葉常不規(guī)范，有時具有兩片以上的子葉。體細(xì)胞胚沒有休眠而直接形成植株。10.、影響體細(xì)胞胚胎發(fā)生的因素:植物種類和基因型。培養(yǎng)基。 除2,4D外，ABA對植物體細(xì)胞胚的發(fā)生也起到重要的調(diào)控作用。由于胚處在胚囊中，胚囊可以供給胚發(fā)育的特殊營養(yǎng)物質(zhì)。胚發(fā)育越小，培養(yǎng)時就需要更多更復(fù)雜的營養(yǎng)物質(zhì)。4. 胚發(fā)育可分為異養(yǎng)和自養(yǎng)兩個階段:異養(yǎng)階段:在此階段,胚主要依靠胚乳及周圍的母體組織吸取養(yǎng)分.自養(yǎng)階段:開始于心形胚后期，此時，胚在代謝上已能由基本的無機(jī)鹽和糖合成生長所需要的物質(zhì).原胚球型胚心形胚魚雷胚成熟胚小苗:1)用于胚的挽救獲得遠(yuǎn)緣雜種。3) 誘導(dǎo)胚狀體及胚性愈傷組織。 5)稀有植物的繁殖:成熟胚培養(yǎng):成熟胚一般指從種子中剝離的發(fā)育完全的胚。實質(zhì)是胚的離體萌發(fā)過程離休胚培養(yǎng)的發(fā)育方式 ：1)合子胚發(fā)育途徑；由合子形成球形胚、心形胚、魚雷形胚、子葉形胚，形成完整的種子，成苗2)“胚”的早熟萌發(fā)；幼胚離體培養(yǎng)不是促進(jìn)胚正常發(fā)育成熟形成幼苗，而是以幼小的胚的形態(tài)早熟萌發(fā)形成畸形苗。幼小的胚在離體培養(yǎng)時多數(shù)情況下脫分化形成愈傷組織。10. 成熟胚的培養(yǎng)1）材料的消毒與接種附加成分2）培養(yǎng)基 大量元素和微量的無機(jī)鹽為基本成分 谷氨酰胺作為氮源，可以促進(jìn)胚生長 植物天然浸提物（YE）促進(jìn)胚生長 　　　　　　　　硫氨素促進(jìn)胚根的伸長 生長素低濃度促進(jìn)胚的發(fā)育（胚根） 赤霉素促進(jìn)有后熟作用的種子萌發(fā) 3） 培養(yǎng)條件：、加熱滅菌后PH通常會下降；12小時光照和25C，熱帶蘭花雜交種胚30C11. 幼胚培養(yǎng)方法：（1） 材料的選擇與滅菌：取材時期：大多數(shù)幼胚成功的實例證明，適宜于幼胚發(fā)育時期多為心形胚至魚雷形胚。操作：取回大田或溫室里授粉受精后的植物子房，用70%的酒精進(jìn)行表面消毒，%氯化汞滅菌1030min，用無菌水沖洗34次，即可用于胚的分離和培養(yǎng)。胚齡和胚的發(fā)育形態(tài)：一般認(rèn)為胚齡是影響胚培養(yǎng)成功的關(guān)鍵因素之一。心型胚:葉小白色,真葉發(fā)生需34周,后面的生長也不良。（二）幼胚的分離及培養(yǎng)：幼胚剝離：幼胚剝離是關(guān)鍵的關(guān)鍵，幼胚是一種半透明、高粘稠狀組織，剝離過程極易失水干縮，因此操作速度要迅速。接種培養(yǎng)：了解培養(yǎng)對象的特性，比如休眠、春化作用、胚萌發(fā)溫度等葡萄胚挽救的幾個步驟圖例：a. 取材料：材料處理，滅菌剝胚；2）取胚；3）胚發(fā)育階段；4）正常成苗；5）培養(yǎng)室煉苗；6）溫室煉苗；7）移栽大田，生長為壯苗12. 幼胚培養(yǎng)的關(guān)鍵技術(shù)：取材時期、幼胚剝離、培養(yǎng)基設(shè)計、培養(yǎng)條件的控制（是否需要特殊處理）13. 幼胚培養(yǎng)條件：1）培養(yǎng)基：基本培養(yǎng)基：MS N6 White等糖的作用：蔗糖是最好的碳源之一，主要調(diào)解滲透壓的作用無機(jī)氮以硝酸鹽、銨鹽的形式存在可以提高鉀和鈣的濃度氨基酸：谷氨酰胺刺激胚的生長；水解蛋白維生素：促進(jìn)幼胚的早期發(fā)育植物生長調(diào)節(jié)劑天然有機(jī)物：胚乳看護(hù)培養(yǎng)：大麥離體胚，在含有同種胚乳的培養(yǎng)基中，對胚的生長促進(jìn)。大麥黑麥雜交胚，在含有大麥胚乳的培養(yǎng)基中，成苗率提高3040%2）環(huán)境條件：溫度：胚培養(yǎng)2530℃；光照：黑暗或弱光，光對胚胎發(fā)育有輕微抑制作用3）植物材料：胚柄→胚柄是一個短命結(jié)構(gòu)，球形胚時期，胚柄發(fā)育成最大。被子植物的胚乳是三倍體由兩個中央極核與一個精核結(jié)合而成；裸子植物的胚乳是單倍體（由大孢子發(fā)育而來）。；2）胚乳細(xì)胞的全能性。4）研究離體培養(yǎng)條件下胚和胚乳的關(guān)系。目前研究概況：12科，40多種。2）禾本科：大麥、玉米和水稻。16. 胚乳培養(yǎng)方法：1）胚乳外植體的選擇制備。從盛花期后胚乳組織進(jìn)入細(xì)胞型期的是時間玉米為812天，小麥為8天，黃瓜為716天2）胚乳愈傷組織的誘導(dǎo)及器官分化：（1）器官發(fā)生途徑，先生成芽后生成根。17. 影響胚乳細(xì)胞染色體穩(wěn)定性的因素：胚乳類型、胚乳愈傷組織發(fā)生位置、培養(yǎng)基中外源激素的種類和水平、外源激素的配比不僅決定胚乳細(xì)胞的增值和分化還影響胚乳細(xì)胞染色體的倍性變化造成染色體倍性變化的主要原因有：培養(yǎng)基中的外源激素；繼代的次數(shù)越多，倍性越不穩(wěn)定。2）形態(tài)建成 器官發(fā)生：巴豆(先根)、麻風(fēng)樹（先芽）最后在分化培養(yǎng)基上沒能發(fā)育成小植株。例如（枸杞：BA、BA+NAA分化7785%：獼猴桃：ZT）；體胚發(fā)生：柑橘、桃、棗20. 三倍體后代特征：1）形態(tài)特征 被子植物通過胚乳培養(yǎng)得到三倍體植株，產(chǎn)生無籽果實。發(fā)育后期產(chǎn)生細(xì)胞壁，形成胚乳細(xì)胞。2） 細(xì)胞型胚乳：無游離狀態(tài)，核的分裂伴隨壁的形成。：1）發(fā)育早期的胚乳，接種不方便，愈傷組織的誘導(dǎo)頻率很低。3）接近成熟或完全成熟的胚乳，愈傷組織誘導(dǎo)頻率很低。處于生長旺盛期的不需要，生理活性微弱的胚乳(完全成熟的胚乳）必須借助于胚的增殖作用，赤霉素可替代胚的作用：培養(yǎng)基：MS、水解酪蛋白、酵母提取物、蔗糖、外源激素、pH；溫度：25℃；光照：因物種而異：1）胚乳培養(yǎng)再生植株指明了全能性理論；2）研究胚和胚乳的關(guān)系及胚乳的組織功能；3）再生植株多為三倍體，產(chǎn)生無籽果實；4）可以從胚乳愈傷中分離和篩選各種類型的非整倍體的植株；5）胚乳細(xì)胞是研究淀粉、脂類和蛋白質(zhì)天然產(chǎn)物代謝途徑的理想系統(tǒng)：含義：將胚珠從母體上分離出來，在人工控制下，進(jìn)行離體培養(yǎng)，使其生長發(fā)育形成幼苗的技術(shù)。 3. 胎座和子房對胚珠培養(yǎng)的影響 二)培養(yǎng)基對胚珠培養(yǎng)的影響：椰子汁、酵母提取物、水解酪蛋白、氨基酸、蔗糖等矮牽牛胚珠培養(yǎng)：授粉后7d，胚珠處于球形胚期，剝離后放在蔗糖濃度4% 10%的培養(yǎng)基上，可發(fā)育成成熟的種子。子房：由子房壁、胎座、胚珠組成培養(yǎng)方法：外植體的制備與胚珠培養(yǎng)方法相似； 培養(yǎng)基；椰子汁、酵母提取物（YE）、B族維生素 IAA第4節(jié) 植物離體授粉：在人工控制下將未授粉的胚珠或子房從母體上分離下來，進(jìn)行無菌培養(yǎng)，并以一定的方式授以無菌花粉，使之在試管內(nèi)實現(xiàn)受精的技術(shù)，也稱試管受精，離體受精。離體授粉程序確定時間—去雄套袋制備無菌子房或胚珠—制備無菌花粉試管授粉一）胚珠試管受精 1）取胚珠，將子房表面消毒，在無菌的條件下將子房剝下，除去花托，取出帶胚座的裸露胚珠，接種于配好的培養(yǎng)基上。鈣、硼離子對花粉萌發(fā)和花分管生長的促進(jìn)有重要作用二）子房離體授粉 通過人工的方法把花粉直接引入子房使花粉粒在子房腔內(nèi)萌發(fā)并完成受精過程。1）直接引入法，用刀片在子房壁上開個切口，把花粉懸浮液滴于切口處2）注射法，在子房上切2個注射孔，一個在子房頂端，一個在其對面靠近子房基部，用注射器吸取花粉懸液從基部注射孔注入。三）雌蕊離體授粉，在花藥尚未開列開裂時切取母本花蕾，消毒后在無菌的條件下除去花瓣、雄蕊、保留萼片，將整個雌蕊接種于培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)的當(dāng)天或次日在其柱頭上授以無菌的父本花粉。4） 基因型；5）花粉粒的數(shù)量及萌發(fā)力第4章 植物細(xì)胞培養(yǎng)（plant cell culture）：指對植物器官或愈傷組織上分離出來的單細(xì)胞(或小細(xì)胞團(tuán))進(jìn)行培養(yǎng)，形成單細(xì)無性系或再生植物的技術(shù)。分類：1）根據(jù)規(guī)模：小規(guī)模培養(yǎng)、大批量培養(yǎng)；2）根據(jù)培養(yǎng)方式：懸浮培養(yǎng)、平板培養(yǎng)、看護(hù)培養(yǎng)、紙橋培養(yǎng)法3）根據(jù)要求的產(chǎn)物：誘變的細(xì)胞培養(yǎng)、生產(chǎn)次生產(chǎn)物的細(xì)胞培養(yǎng)2. 植物細(xì)胞培養(yǎng)的特性:1）植物細(xì)胞較微生物細(xì)胞大得多，有纖維素細(xì)胞壁。 5）因為有細(xì)胞壁, 培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)物滯留于細(xì)胞內(nèi)，產(chǎn)量較低； 6）細(xì)胞培養(yǎng)過程有結(jié)構(gòu)與功能全能性,因而易分化。3. 植物細(xì)胞培養(yǎng)需要解決的問題:1）氧和二氧化碳的控制，過多氧過少氧均不利于生長；（2）營養(yǎng)物的供應(yīng)； 3）細(xì)胞密度過高引起細(xì)胞團(tuán)聚甚至分化，培養(yǎng)過程中細(xì)胞的分化的防止。：1)擇適宜的外植體； 2)誘導(dǎo)疏松愈傷組織； 3)選