【正文】 、生長速度有個明確的認識，這個過程可能需要一周左右（指熟練的人） 。體外培養(yǎng)的細胞，按其生長方式主要分為貼壁細胞與懸浮細胞兩大類。1. 培養(yǎng)基顏色的觀察培養(yǎng)基的 pH 直接影響到細胞的生長狀況，大多數(shù)細胞的最適 pH 為 左右。我們常用的血清為小牛血清，培養(yǎng)基中血清的濃度為 10%。A： 血清一般在20℃保存；B： 體積較大的血清，融化后應分裝后，20℃保存；C： 對于未滅活的血清，在常溫下溶解后，56℃水浴中滅活30min，再分裝于20℃保存。一般情況下，2~3天更換一次。培養(yǎng)瓶從孵箱中拿出來后，最好豎立著放，不要平放（培養(yǎng)基易沖出瓶蓋，導致染菌） ，包括在超凈臺中的操作。2) 懸浮細胞A： 培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基不多時：直接加入新培養(yǎng)基（培養(yǎng)瓶可以豎立著放） ；B： 培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基過多時：將細胞連同培養(yǎng)基一起轉移到離心管中，1000rpm，5min；倒掉上清液，加入新的培養(yǎng)基到離心管中，吹打成細胞懸液，轉移到培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。貼壁細胞：A： 倒掉培養(yǎng)基；B： 加入 PBS 清洗（必須 ，清洗掉含血清的培養(yǎng)基，一方面可以節(jié)約消化液，又能盡快的消化細胞，并且好控制消化時間） ；C： 加入消化液以覆蓋住細胞為準，不宜過多，37℃孵箱中消化2~3min 左右；D： 顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)細胞質(zhì)回縮、細胞間隙增大后（細胞變圓） ，立即加入 12ml 含血清的培養(yǎng)基終止消化，棄去；E： 重新加入 12 ml 含血清的培養(yǎng)基，用移液管或移液槍吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液，反復吹打瓶壁細胞，吹打時應從瓶底一邊開始到另一邊，以確保瓶壁上細胞均被吹打下來。懸浮細胞：操作同上述懸浮細胞換液，僅是在細胞計數(shù)后，將合適數(shù)量的細胞懸液，分配到新培養(yǎng)瓶中。應選擇在對數(shù)生長期的細胞（密度大約為 90%）進行消化傳代或凍存B： 對于貼壁細胞，消化傳代后第二天（細胞一般情況下已經(jīng)貼壁了） ，用 PBS 清洗，換成新培養(yǎng)基。D： 對于某些細胞貼壁較慢或難的細胞，細胞培養(yǎng)皿可以先用一些14 / 32非特異性的物質(zhì)修飾，這些物質(zhì)可能帶正電，如明膠或多聚 D 型賴氨酸處理（新的一次性塑料培養(yǎng)皿不需如此處理） ，再加入細胞懸液。明膠液的濃度一般為 ~%。第 7 節(jié) 細胞計數(shù)1. 血球計數(shù)板的使用血球計數(shù)板一般有二個小室，每個室中細刻 9 個 1mm2 大正方形（見下圖），其中上下左右 4 個角落之正方形再細刻 16 個小格，深度均為 。使用時，計數(shù) 4 大正方形內(nèi)之總的細胞數(shù)目，求平均值，再乘以 104，即為每 ml 溶液中細胞數(shù)目，再乘以稀釋倍數(shù)，即可得出母液中細胞的濃度。E： 或者吸 10?l 細胞懸液到一離心管中，加入 10?l 臺盼藍染液（％）或苯胺黑，活細胞不會被染色，加入染液后就可以在顯微鏡下區(qū)別活細胞和死細胞。（細胞懸液的細胞數(shù)）/ ml ＝ （ 四個大格子細胞數(shù)/4）10 4稀釋倍數(shù)F： 用完后用紙或酒精棉擦凈計數(shù)板上的液體。如下圖，如果上面壓邊線的白色球統(tǒng)計了，那么下方壓邊線的黑色球就不用統(tǒng)計在內(nèi)了。C： 細胞一定要吹打均勻后才可計數(shù)。使用液：使用時，用 PBS 稀釋母液至 ％即可。2. 細胞凍存（慢凍 4℃ 冰箱 30min，20℃ 放置 2h，70℃存放）1) 取對數(shù)生長期的細胞（細胞密度約為 90%左右） ，用 PBS 清洗一遍，加入消化液，消化，含血清培養(yǎng)基終止消化后，離心。3) 用膠布封好凍存管接口處，在凍存管中表明細胞名稱、細胞代數(shù)、凍存日期、操作人名字。也可將凍存管用棉花包裹后，直接放入70℃。第 9 節(jié) MTT 法測定細胞活力或細胞增殖MTT儲存液：用PBS配置5mg/ml MTT， 濾膜過濾除菌后，4℃保存。操作流程：去除或不去除原培養(yǎng)液 按照 1：10 的比例加入 MTT(如 90μL 培養(yǎng)基，10μLMTT) 在培養(yǎng)箱中孵育 14 小時（視細胞類型及密度而定） 去除染色液 加入 100 或 150μL DMSO 振蕩器振蕩 10min 使結晶溶解 18 / 32酶標儀檢測注意事項：1) MTT 的檢測波長有單波長 490，570 或雙波長 570650 等，如選擇單波長則最好提前對本底進行掃描；2) 如所測細胞為懸浮細胞或貼壁不牢，則應離心（1000rpm, 1020min）后再去除染色液，加入 DMSO。 第二章 分子實驗操作第 1 節(jié) PCR 引物設計與實驗操作1. 引物設計PCR 引物設計的目的是為了找到一對合適的核苷酸片段，使其能有效地擴增模板 DNA 序列。要設計引物首先要找到 DNA 序列的保守區(qū)。如這個區(qū)域單鏈能形成二級結構，就要避開它?，F(xiàn)在可以在這一保守區(qū)域里設計一對引物。引物確定以后，可以對引物進行必要的修飾，例如可以在引物的 5′端加酶切位點序列；標記生物素、熒光素、地高辛等，這對擴增的特異性影響不大。這里還需提醒的是 3′端不要終止于密碼子的第 3 位，因為密碼子第 3 位易發(fā)生簡并，會影響擴增的特異性與效率。② 產(chǎn)物不能形成二級結構。④ G+C 含量在 40%~60%之間。⑥ 引物自身不能有連續(xù) 4 個堿基的互補。⑧ 引物 5′端可以修飾。⑩ 引物 3′端要避開密碼子的第 3 位。如果根據(jù)文獻中的引物及條件擴增不出來，再自行設計，首先引物的全序列可以從 Pubmed 網(wǎng)站上獲得，再利用軟件 Primer ，參照上述設計原則，進行設計，設計好的引物再到 Pubmed 網(wǎng)站上利用 BLAST 進行驗證。如果用于 RNA 稀釋或逆轉錄實驗，1‰DEPC水應高壓滅菌，4℃保存。3) 50電泳緩沖液（ TAE）：先配制 ， 的 EDTA 溶液：將 EDTANa2 加入160ml 蒸餾水中，攪拌。再配制 50TAE 溶液：在 400ml 蒸餾水中溶解 121gTris 堿，加入 冰醋酸和 50ml ，最后用蒸餾水定容至500ml，室溫存放。凝膠的濃度與被分離的DNA 片段成反比，凝膠的濃度越低，能被分離的 DNA 就越大。待融化的瓊脂糖溶也稍微冷卻，加入 EB 溶液，充分混勻。5) 加樣緩沖液（6Loading Buffer）：具體可參照《分子克隆》書上。2. 實驗器具的處理與準備1) 塑料制品（槍頭，eppendorf 管，PCR 薄壁管）：將塑料制品逐個浸泡于 1‰DEPC 水中（必要時小槍頭需要用吸管等工具打入 DEPC 水） ，浸泡過夜，然后撈出，高壓滅菌，80℃烘箱中烘干，試驗時再將槍頭放入槍頭盒。3) 金屬制品洗凈后，錫箔紙包裹，180℃烘烤 8h。5) 根據(jù) OD260、OD 280 比值來估計提取樣品中 RNA 的純度，~ 范圍認為 RNA 純度很高。5. 逆轉錄具體實驗步驟及采用的溫度應參照所用逆轉錄酶的說明書和所選擇的cDNA 引物（隨機六聚體引物或 Oligo(dT)） 。補 1‰DEPCtreated water 至 再按以下依次加入：MMLV 5buffer 10μlRiboraclease inhibitor 10 nm dNTP 5μl MMLV 反轉錄酶 2μl42℃，60min；70℃，5min 得到 cDNA ,20℃保存。補 1‰DEPCtreated water 至 再按以下依次加入：MMLV 5buffer 10μlRiboraclease inhibitor 10 nm dNTP 5μl MMLV 反轉錄酶 2μl42℃，60min；70℃，5min 得到 cDNA ,20℃保存。各個組份都能影響 PCR 結果的好壞。23 / 32反應體系 (30ul)Template RNA 3μl10buffer 3μlMg2+ dNTP μl up primer 1μldown primer 1μldd H2O Taq polymerase 反應條件94℃ 3min 1 cycle94℃ 1min52℃ 45sec 29 cycles72℃ 1min72℃ 10min 1 cycle4℃ ∞（保存）對 PCR 反應體系中主要因素的影響作一概述：1) 反應緩沖液：一般隨 Taq DNA 聚合酶供應。Mg 2+的濃度對反應的特異性及產(chǎn)量有著顯著影響。在各種單核苷酸濃度為 200μM 時，Mg 2+為 較合適。在高濃度 DNA 及 dNTP 條件下進行反應時，也必須相應調(diào)節(jié)Mg2+的濃度。2) dNTP ：高濃度 dNTP 易產(chǎn)生錯誤摻入，過高則可能不擴增；但濃度過低，將降低反應產(chǎn)物的產(chǎn)量。四種脫氧三磷酸核苷酸的濃度應相同，如果其中任何一種的濃度明顯不同于其它幾種時（偏高或偏低），就會誘發(fā)聚合酶的錯誤摻24 / 32入作用，降低合成速度，過早終止延伸反應。因此，dNTP 的濃度直接影響到反應中起重要作用的 Mg2+濃度。酶量過多將導致產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物。當降低反應體積時（如 20μl 或 50μl），一般酶的用量仍不小于 2U，否則反應效率將降低。雖然 PCR 可以用極微量的樣品（甚至是來自單一細胞的 DNA）作為摸板，但為了保證反應的特異性，一般還宜用 μg 水平的基因組 DNA 或104 拷貝的待擴增片段作為起始材料。5) Mg2+濃度：Mg 2+對 PCR 擴增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在一般的PCR 反應