【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 2 ml 含血清的培養(yǎng)基，用移液管或移液槍吸取瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，吹打時(shí)應(yīng)從瓶底一邊開始到另一邊，以確保瓶壁上細(xì)胞均被吹打下來(lái)。 （吹打不宜過(guò)猛，避免過(guò)多的泡沫形成）F： 吹打均勻，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，吸取合適數(shù)量的細(xì)胞懸液，至新培養(yǎng)瓶中，再補(bǔ)足培養(yǎng)基（50 ml 培養(yǎng)瓶可加 45 ml 培養(yǎng)基） 。懸浮細(xì)胞：操作同上述懸浮細(xì)胞換液，僅是在細(xì)胞計(jì)數(shù)后，將合適數(shù)量的細(xì)胞懸液，分配到新培養(yǎng)瓶中。注意：A： 不應(yīng)待細(xì)胞長(zhǎng)得特別滿的情況下，消化細(xì)胞，因?yàn)檫@時(shí)細(xì)胞的活力并非最好。應(yīng)選擇在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞（密度大約為 90%）進(jìn)行消化傳代或凍存B： 對(duì)于貼壁細(xì)胞，消化傳代后第二天（細(xì)胞一般情況下已經(jīng)貼壁了） ，用 PBS 清洗，換成新培養(yǎng)基。C： 對(duì)于貼壁細(xì)胞，消化吹打成細(xì)胞懸液時(shí)，也可先將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到離心管中，離心，倒掉上清液，加新培養(yǎng)基吹打成懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后再分配。D： 對(duì)于某些細(xì)胞貼壁較慢或難的細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)皿可以先用一些14 / 32非特異性的物質(zhì)修飾，這些物質(zhì)可能帶正電，如明膠或多聚 D 型賴氨酸處理（新的一次性塑料培養(yǎng)皿不需如此處理） ，再加入細(xì)胞懸液。具體操作：① 將玻璃培養(yǎng)瓶高壓滅菌；② 加入明膠或多聚 D 型賴氨酸，37℃孵箱放置 30min 以上；③ 回收明膠或多聚賴氨酸；④ 將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中。明膠液的濃度一般為 ~%。例如，取 明膠加入 100ml 雙蒸水中，60℃左右水浴加熱溶解，高壓滅菌，4℃保存。第 7 節(jié) 細(xì)胞計(jì)數(shù)1. 血球計(jì)數(shù)板的使用血球計(jì)數(shù)板一般有二個(gè)小室，每個(gè)室中細(xì)刻 9 個(gè) 1mm2 大正方形（見(jiàn)下圖），其中上下左右 4 個(gè)角落之正方形再細(xì)刻 16 個(gè)小格，深度均為 。血球計(jì)數(shù)板上方蓋上蓋玻片后，每個(gè)大正方形之體積為 1mm2=104ml。使用時(shí)，計(jì)數(shù) 4 大正方形內(nèi)之總的細(xì)胞數(shù)目，求平均值，再乘以 104，即為每 ml 溶液中細(xì)胞數(shù)目，再乘以稀釋倍數(shù)，即可得出母液中細(xì)胞的濃度。2. 計(jì)數(shù)A： 用酒精棉將計(jì)數(shù)板與蓋玻片擦干凈；15 / 32B： 蓋玻片平穩(wěn)地蓋在計(jì)數(shù)板的中間，蓋玻片與計(jì)數(shù)板的邊緣相距 左右；C： 用移液槍取 20μl 左右細(xì)胞懸液，滴加到蓋玻片與計(jì)數(shù)板的邊緣空隙處，讓液體通過(guò)毛細(xì)管現(xiàn)象自然吸附進(jìn)蓋玻片下計(jì)數(shù)板的小室中；D： 顯微鏡下統(tǒng)計(jì) 4 個(gè)方格中的細(xì)胞數(shù)目，求平均值，即可得到細(xì)胞懸液中細(xì)胞濃度， （比如：四個(gè)方格中的細(xì)胞數(shù)分別是1117 和 14，平均為 16，那么細(xì)胞濃度為 16104=105個(gè)/ml） 。E： 或者吸 10?l 細(xì)胞懸液到一離心管中，加入 10?l 臺(tái)盼藍(lán)染液（％）或苯胺黑，活細(xì)胞不會(huì)被染色，加入染液后就可以在顯微鏡下區(qū)別活細(xì)胞和死細(xì)胞。如細(xì)胞密度太高，可稀釋后計(jì)數(shù)。（細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)）/ ml ＝ （ 四個(gè)大格子細(xì)胞數(shù)/4）10 4稀釋倍數(shù)F： 用完后用紙或酒精棉擦凈計(jì)數(shù)板上的液體。 注意：A： 計(jì)數(shù)時(shí)應(yīng)注意一個(gè)原則“壓上不壓下，壓左不壓右” ，也就是說(shuō)計(jì)數(shù)時(shí)，如果將方格上方邊緣線上細(xì)胞統(tǒng)計(jì)了，那么方格下方邊緣線上的細(xì)胞就不用統(tǒng)計(jì)了。如下圖，如果上面壓邊線的白色球統(tǒng)計(jì)了，那么下方壓邊線的黑色球就不用統(tǒng)計(jì)在內(nèi)了。16 / 32B： 吸取的液體不宜過(guò)多，否則計(jì)數(shù)不準(zhǔn)，要靠蓋玻片下毛細(xì)管作用將液體填充到小室中。C： 細(xì)胞一定要吹打均勻后才可計(jì)數(shù)。3. 試劑的配制： 4％臺(tái)盼藍(lán)母液：稱取 4 克臺(tái)盼藍(lán)，加入少量蒸餾水研磨，加雙蒸水至 100 毫升，用濾紙過(guò)濾，4℃保存。使用液：使用時(shí)，用 PBS 稀釋母液至 ％即可。第 8 節(jié) 細(xì)胞復(fù)蘇與凍存1. 細(xì)胞復(fù)蘇（快速?gòu)?fù)蘇）1) 取一 250ml 燒杯或一廢液缸裝上 38~39℃溫水；2) 從70 ℃或液氮罐中迅速取出所需細(xì)胞凍存管，放入溫水中，快速搖晃，使其盡可能快的融化（最好控制在 1min 左右） ；3) 完全融化后，立即從水中取出，1000rpm，離心 5min；4) 凍存管外面用 75%酒精噴灑并擦拭，移至超凈臺(tái)中；17 / 325) 在酒精燈火焰上灼燒后，小心揭掉凍存管上的膠布，將凍存管中上清液倒掉，加入培養(yǎng)基，輕輕吹打；6) 再將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，加入充足的培養(yǎng)基，吹打均勻，孵箱培養(yǎng)。2. 細(xì)胞凍存（慢凍 4℃ 冰箱 30min，20℃ 放置 2h，70℃存放）1) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞（細(xì)胞密度約為 90%左右） ，用 PBS 清洗一遍，加入消化液，消化，含血清培養(yǎng)基終止消化后，離心。2) 在超凈臺(tái)中，倒掉上清液，加入凍存液（培養(yǎng)基：血清：DMSO=7:2:1） ，吹打均勻，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至凍存管中（體積不宜過(guò)滿） 。3) 用膠布封好凍存管接口處，在凍存管中表明細(xì)胞名稱、細(xì)胞代數(shù)、凍存日期、操作人名字。4) 將凍存管放入 4℃ 冰箱 30min，再轉(zhuǎn)移至20℃，放置 2h，最后轉(zhuǎn)移至70℃ 存放（有條件的話，在70℃過(guò)夜后，可將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至液氮中長(zhǎng)期保存） 。也可將凍存管用棉花包裹后，直接放入70℃?？傊?，凍存時(shí)掌握一個(gè)原則，慢凍（降溫速度為 1～3℃/min） 。第 9 節(jié) MTT 法測(cè)定細(xì)胞活力或細(xì)胞增殖MTT儲(chǔ)存液：用PBS配置5mg/ml MTT， 濾膜過(guò)濾除菌后，4℃保存。MTT工作液：用無(wú)血清培養(yǎng)基按照1：10稀釋后使用。操作流程：去除或不去除原培養(yǎng)液 按照 1：10 的比例加入 MTT(如 90μL 培養(yǎng)基，10μLMTT) 在培養(yǎng)箱中孵育 14 小時(shí)（視細(xì)胞類型及密度而定） 去除染色液 加入 100 或 150μL DMSO 振蕩器振蕩 10min 使結(jié)晶溶解 18 / 32酶標(biāo)儀檢測(cè)注意事項(xiàng)：1) MTT 的檢測(cè)波長(zhǎng)有單波長(zhǎng) 490，570 或雙波長(zhǎng) 570650 等，如選擇單波長(zhǎng)則最好提前對(duì)本底進(jìn)行掃描；2) 如所測(cè)細(xì)胞為懸浮細(xì)胞或貼壁不牢，則應(yīng)離心（1000rpm, 1020min）后再去除染色液，加入 DMSO。3) 加入 DMSO 振蕩后，請(qǐng)及時(shí)測(cè)定，否則顏色會(huì)越來(lái)越深，影響測(cè)定結(jié)果。 第二章 分子實(shí)驗(yàn)操作第 1 節(jié) PCR 引物設(shè)計(jì)與實(shí)驗(yàn)操作1. 引物設(shè)計(jì)PCR 引物設(shè)計(jì)的目的是為了找到一對(duì)合適的核苷酸片段，使其能有效地?cái)U(kuò)增模板 DNA 序列。因此，引物的優(yōu)劣直接關(guān)系到 PCR 的特異性與成功與否。要設(shè)計(jì)引物首先要找到 DNA 序列的保守區(qū)。同時(shí)應(yīng) 預(yù)測(cè)將要擴(kuò)增的片段單鏈?zhǔn)欠裥纬啥?jí)結(jié)構(gòu)。如這個(gè)區(qū)域單鏈能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，就要避開它。如這一段不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，那就可以在這一區(qū)域設(shè)計(jì)引物。現(xiàn)在可以在這一保守區(qū)域里設(shè)計(jì)一對(duì)引物。一般引物長(zhǎng)度為 15~30 堿基，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為 100~600 堿基對(duì)。引物確定以后，可以對(duì)引物進(jìn)行必要的修飾，例如可以在引物的 5′端加酶切位點(diǎn)序列；標(biāo)記生物素、熒光素、地高辛等，這對(duì)擴(kuò)增的特異性影響不大。但 3’端絕對(duì)不能進(jìn)行任何修飾，因?yàn)橐锏难由焓菑?3′端開始的。這里還需提醒的是 3′端不要終止于密碼子的第 3 位，因?yàn)槊艽a子第 3 位易發(fā)生簡(jiǎn)并，會(huì)影響擴(kuò)增的特異性與效率。綜上所述可以歸納十條 PCR 引物的設(shè)計(jì)原則：19 / 32① 引物應(yīng)用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)并具有特異性。② 產(chǎn)物不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。③ 引物長(zhǎng)度一般在 15~30 堿基之間。④ G+C 含量在 40%~60%之間。⑤ 堿基要隨機(jī)分布。⑥ 引物自身不能有連續(xù) 4 個(gè)堿基的互補(bǔ)。⑦ 引物之間不能有連續(xù) 4 個(gè)堿基的互補(bǔ)。⑧ 引物 5′端可以修飾。⑨ 引物 3′端不可修飾。⑩ 引物 3′端要避開密碼子的第 3 位。引物設(shè)計(jì)一般可以先參考文獻(xiàn)中的。如果根據(jù)文獻(xiàn)中的引物及條件擴(kuò)增不出來(lái)，再自行設(shè)計(jì)，首先引物的全序列可以從 Pubmed 網(wǎng)站上獲得，再利用軟件 Primer ，參照上述設(shè)計(jì)原則，進(jìn)行設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)好的引物再到 Pubmed 網(wǎng)站上利用 BLAST 進(jìn)行驗(yàn)證。2. 準(zhǔn)備工作1. 試劑配制1) 1‰DEPC 水的配制： 1000ml 去離子水中加入 1mlDEPC，靜放使其完全溶解，室溫保存。如果用于 RNA 稀釋或逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)，1‰DEPC水應(yīng)高壓滅菌，4℃保存。2) 75%乙醇溶液（RNA 提取時(shí)現(xiàn)配）： 無(wú)水乙醇+‰DEPC水。3) 50電泳緩沖液（ TAE）：先配制 ， 的 EDTA 溶液：將 EDTANa2 加入160ml 蒸餾水中，攪拌。用 NaOH 調(diào)節(jié)溶液至 ，再用蒸餾水定容至200ml。再配制 50TAE 溶液：在 400ml 蒸餾水中溶解 121gTris 堿，加入 冰醋酸和 50ml ，最后用蒸餾水定容至500ml，室溫存放。4) 瓊脂糖溶液：20 / 32瓊脂糖凝膠可以灌制成不同大小和孔徑。凝膠的濃度與被分離的DNA 片段成反比，凝膠的濃度越低，能被分離的 DNA 就越大。PCR 產(chǎn)物大小與電泳分析中瓊脂糖濃度產(chǎn)物大小/Kb 瓊脂糖濃度/%5~60 1~20 ~10 ~7 ~6 ~3 ~2 瓊脂糖溶液的配制（2%）：取 1g 瓊脂糖，倒入錐形瓶中，加入 50ml 1TAE 緩沖液，電爐或微波爐中煮至沸騰。待融化的瓊脂糖溶也稍微冷卻，加入 EB 溶液，充分混勻。將熱的凝膠液倒入已放置好梳子的電泳板中，室溫放置 30min 左右后進(jìn)行電泳。5) 加樣緩沖液（6Loading Buffer）：具體可參照《分子克隆》書上。%溴酚藍(lán)+40%（m/V ）蔗糖溶液。2. 實(shí)驗(yàn)器具的處理與準(zhǔn)備1) 塑料制品（槍頭，eppendorf 管，PCR 薄壁管）：將塑料制品逐個(gè)浸泡于 1‰DEPC 水中（必要時(shí)小槍頭需要用吸管等工具打入 DEPC 水） ，浸泡過(guò)夜，然后撈出，高壓滅菌，80℃烘箱中烘干，試驗(yàn)時(shí)再將槍頭放入槍頭盒。2) 玻璃制品洗凈后泡酸過(guò)夜，自來(lái)水、蒸餾水及雙蒸水洗凈后，在 1‰DEPC 水中浸泡過(guò)夜，烘干后，用錫箔紙包裹，180℃烘烤 8h。