【正文】 板底即可，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，在有些變圓時(shí)，即用10ul槍在顯微鏡下直接吸克隆，放入事先準(zhǔn)備好的加了培養(yǎng)基的96孔板內(nèi)，先吸大的克隆，在胰酶完全起到作用使細(xì)胞松散擴(kuò)散開了時(shí)，已經(jīng)吸了將近十個(gè)克隆了，動(dòng)作快一些時(shí)能吸十幾個(gè)克隆，我做過(guò)幾次了效果很好，沒有出現(xiàn)污染。長(zhǎng)到大概80％以上的時(shí)候作轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后一天消化，傳到一個(gè)大皿（1：6）或者兩個(gè)大皿（1：12）。再過(guò)一天后加入帶G418的培養(yǎng)基。依據(jù)細(xì)胞不同，大概從加入G418的第三天到第八天之間細(xì)胞開始出現(xiàn)大量死亡，活下來(lái)的細(xì)胞就形成單克隆。6。我們基本上都是這樣pick stable的，除非一些對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑止作用強(qiáng)大或者apoptosis的inducer之類的基因比較難挑到stable外，一般還都能挑到stable。對(duì)于那些轉(zhuǎn)染效率很低的細(xì)胞，我會(huì)連續(xù)轉(zhuǎn)染三次（中間如果細(xì)胞長(zhǎng)滿了就傳代），好像比較有效。，再傳代時(shí)保證板子不影響細(xì)胞貼壁，避免出現(xiàn)傳代后細(xì)胞浮起來(lái)后死亡的現(xiàn)象。復(fù)蘇后加G418傳代2次，然后按部就班。（需要隔一段時(shí)間再加壓篩一次），細(xì)胞也是死的厲害，不過(guò)還是可以篩到，不過(guò)需要用合適的濃度。：轉(zhuǎn)染加藥一段時(shí)間后，板子上出現(xiàn)了幾個(gè)克隆，如果有幾十個(gè)克隆，然后挑其中七八個(gè)克隆到24孔板里繼續(xù)加藥篩選，等24孔長(zhǎng)滿后再轉(zhuǎn)到6孔板繼續(xù)加藥篩選，6孔板里長(zhǎng)差不多滿后，每孔消化下來(lái)大概一半做WB鑒定目的基因表達(dá)，剩一半留著繼續(xù)加藥培養(yǎng)，等WB結(jié)果出來(lái)有陽(yáng)性的孔就保留下來(lái)，陰性的丟掉。原因：瞬轉(zhuǎn)是在強(qiáng)啟動(dòng)子下,穩(wěn)轉(zhuǎn)時(shí)你得到的細(xì)胞株可能失去了此啟動(dòng)子,或者是改變了細(xì)胞的生理特性!用WB和瞬轉(zhuǎn)對(duì)照鑒定一下!，一般兩月后（傳代10代以上）還表達(dá)你想要蛋白的單克隆可以認(rèn)為是整合了質(zhì)粒的。方案二：（1）配制1M HEPES： HEPES（緩沖能力更強(qiáng)）粉末溶于100ml ddH2O，10N NaOH（加量較多），過(guò)濾除菌（較難過(guò)濾），4℃保存，終濃度為1mol/L。注：實(shí)驗(yàn)中采用方案二時(shí)效果較好。200 ug/ml 300 ug/ml 400 ug/ml 500 ug/ml 600 ug/ml 700 ug/ml 800 ug/ml 900 ug/ml 1000 ug/ml 1100 ug/ml 1200 ug/ml3ml完全培養(yǎng)基 996 992 G418(500mg/ml) ：將凍存的細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)，傳代3至4次使細(xì)胞達(dá)到良好的生長(zhǎng)狀態(tài),鋪24孔板（20000/孔），12h換液，加篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)。 注：實(shí)驗(yàn)中所確定的最佳篩選濃度為1200ug/ml。 轉(zhuǎn)染24小時(shí)后加最佳篩選濃度培養(yǎng)基，隔天換液。（換液后培養(yǎng)過(guò)夜），細(xì)胞達(dá)50%80%時(shí)，吸出所有培養(yǎng)液，離心30004000rpm，加入2倍體積新鮮最佳篩選濃度培養(yǎng)液，混勻4℃?zhèn)溆??；蛘呖梢栽黾友鍧舛扰囵B(yǎng)，例如原來(lái)用10%血清，此時(shí)則可以采用20%血清。●套環(huán)法：用套環(huán)套住陽(yáng)性克隆，在套環(huán)內(nèi)加胰酶或EDTA消化，把消化液吸到另外一個(gè)新的培養(yǎng)孔中培養(yǎng)。：細(xì)胞大量擴(kuò)增后，①提取總RNA，RTPCR檢測(cè)目的基因的表達(dá) ②western檢測(cè)目的基因。G418篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系總結(jié) 一題也不是很大，那就是：在老外的一本實(shí)驗(yàn)手冊(cè)中提到，在脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染時(shí)所用培養(yǎng)基中最好不加任何抗生素。因?yàn)閼c大霉素、鏈霉素、G418均是氨基糖甙類藥物，其藥理作用完全一樣。有人認(rèn)為用磷酸鈣共沉淀轉(zhuǎn)染法篩選穩(wěn)定整合子較好，但這種觀點(diǎn)是很多年以前的觀點(diǎn)了，而且只是少數(shù)人的觀點(diǎn)。磷酸鈣便宜，但對(duì)溶液配置和實(shí)驗(yàn)操作要求很高，尤其是溶液的PH值，要求精確到小數(shù)點(diǎn)后2位。非脂質(zhì)體是這幾年發(fā)展很快的技術(shù)，轉(zhuǎn)染效率低，細(xì)胞毒性小，價(jià)格也不貴，Qiagen就有一個(gè)系列。有精力就比較一下幾種方法，一般的用達(dá)到目的就行了。G418和篩選篩選之前由于每種細(xì)胞對(duì)G418的敏感性不同，而且不同的廠家生產(chǎn)的相同濃度的G418的活性不盡相同，所以在篩選之前，一定要確定G418的最佳篩選濃度。由于每種細(xì)胞對(duì)G418的敏感性不同，一般變動(dòng)在100ug/ml～1000ug/ml范圍。盡管如此，特性明確的細(xì)胞系G418的最佳用量還是穩(wěn)定的。細(xì)胞系或機(jī)體理論上1/4000孔內(nèi)應(yīng)有4%的匯合度。所以匯合度對(duì)G418篩選結(jié)果的影響很大，一般篩選時(shí)匯合度不宜超過(guò)50%！加藥時(shí)間由于基因轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)之后要一段時(shí)間才能表達(dá)出蛋白質(zhì)。隨著細(xì)胞的代謝G418的濃度和活性都回下降，所以每35天都要更換一次含有G418的篩選液。培養(yǎng)液加藥篩選約6天左右，細(xì)胞會(huì)大量死亡，孔中只剩下的細(xì)胞寥寥無(wú)幾。細(xì)胞之間的信號(hào)會(huì)變得很弱，也會(huì)導(dǎo)致陽(yáng)性細(xì)胞的狀態(tài)不佳甚至死亡。再轉(zhuǎn)染后篩選過(guò)程中就可以應(yīng)用這種培養(yǎng)基。加藥后，在高倍鏡下，陽(yáng)性克隆和陰性克隆很容易辨認(rèn)，在陽(yáng)性克隆下用記號(hào)筆做個(gè)標(biāo)記。最后再用有限稀釋法把陽(yáng)性克隆在96孔板中篩選。但是外源基因如果沒有整合到基因組中的話，目的基因還是很容易丟失的。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延續(xù)，那些丟失了外源基因的細(xì)胞和很少表達(dá)目的基因的細(xì)胞會(huì)占據(jù)優(yōu)勢(shì)，強(qiáng)表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞會(huì)越來(lái)越少。只有經(jīng)過(guò)2次以上的篩選之后才能找到那種我們想要的強(qiáng)分泌目的蛋白的，遺傳穩(wěn)定的細(xì)胞克隆。：取待測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞，制備成細(xì)胞懸液，按等量接種入多孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)6小時(shí)左右開始加藥。: 吸除培養(yǎng)孔中培養(yǎng)基，PBS洗滌一次，每孔中加入不同濃度的篩選培養(yǎng)基。方法同4。在第一輪就篩選出最佳G418濃度的可能性不大，最有可能的是出現(xiàn)這種情況：用某一濃度G418的量在篩選14天后還不能殺死細(xì)胞，而用下一個(gè)梯度的 G418的量在10天前就看不到活細(xì)胞了。比如說(shuō)你要轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞 ，現(xiàn)在我告訴你我測(cè)試過(guò)NIH3T3細(xì)胞對(duì)G418的敏感性，我用的篩選濃度是200 ug/ml。通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定了最佳篩選濃度后，就可以做穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了。c 換液：根據(jù)培養(yǎng)基的顏色和細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每3~5天更換一次篩選培養(yǎng)基。 篩選10～14天后，可見有抗性的克隆出現(xiàn)，停藥培養(yǎng)，待其逐漸增大后；d 挑單克?。褐苽浼?xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)，用培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞到1個(gè)/10ul。待其逐漸增大后轉(zhuǎn)入到48孔中增殖。常見問(wèn)題：？無(wú)怪乎兩種形式：整合在染色體中和存在于細(xì)胞質(zhì)中。？整合是隨機(jī)發(fā)生的非同源性重組，neo基因表達(dá)而目的基因不一定都表達(dá)，所以在篩選之后還要用RTPCR的方法進(jìn)一步鑒定。這個(gè)過(guò)程也是細(xì)胞同化培養(yǎng)基的過(guò)程。在篩選后期，大批細(xì)胞死亡，不換液沒有死亡的細(xì)胞就會(huì)受到死亡細(xì)胞的影響，換液后殘留的少量細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基的同化作用不強(qiáng)，也不利于生長(zhǎng)。培養(yǎng)1014天，以最低細(xì)胞全部死亡濃度為基準(zhǔn)，一般400800左右，篩選時(shí)比該濃度再高一個(gè)級(jí)別，維持使用篩選濃度的一半。 ３. 即是有G418抗性，也不一定有目的基因，單克隆化操作是很重要的。所以，要進(jìn)行單克隆化操作，使得到的均來(lái)自于同一祖先細(xì)胞，遺傳性狀盡量一致，也是對(duì)高表達(dá)細(xì)胞的保護(hù)。1. 可以肯定的是，外源基因與宿主染色體之間的整合是隨機(jī)的而且不是單拷貝的，這點(diǎn)我們做過(guò)FISH驗(yàn)證過(guò)，表達(dá)量與整合數(shù)目，上游序列特性，特定部位DNA立體結(jié)構(gòu)都是相關(guān)的，裝入了SV40只是增加了表達(dá)了數(shù)目，但并不能掩蓋其它因素對(duì)表達(dá)的影響。neo基因也是這樣，而且，同一細(xì)胞中不同基因的拷貝數(shù)不會(huì)相同，不同細(xì)胞同一基因的數(shù)目也不會(huì)相同，這點(diǎn)可以用數(shù)學(xué)關(guān)于泊松分布的觀點(diǎn)理解。 2. 那為什么還要篩選基因？是這樣，用概率論的思維來(lái)理解，某一細(xì)胞內(nèi)隨機(jī)含有一定數(shù)目拷貝數(shù)外源基因，那么，一種基因拷貝數(shù)為0的可能性，及所有拷貝均為另一種基因的概率就很小，很大的概率為外源基因的不均質(zhì)。紅球就是neo，黃球就是你的目的基因。因?yàn)槎叱霈F(xiàn)的概率比是恒定的?？梢栽俚托荒軟]有。4. neo的產(chǎn)物是酶，過(guò)高的G418濃度就要有更多的neo酶來(lái)支持，否則細(xì)胞也要被毒死的，而此時(shí)過(guò)多的酶要求會(huì)對(duì)細(xì)胞代謝造成太大負(fù)擔(dān)，細(xì)胞可能因此無(wú)法完成分裂與增殖，我們?cè)囘^(guò)，即使在同一轉(zhuǎn)染陽(yáng)性細(xì)胞，在不同濃度的G418液中生長(zhǎng)速度也不同，嚴(yán)重形態(tài)也不同。 5. 胰酶的作用不必理會(huì)，有的細(xì)胞受影響，還有的細(xì)胞不受影響，由幾代之后，不受影響的細(xì)胞會(huì)占優(yōu)勢(shì)的。在第10天左右就手挑單克隆或者96孔板單克隆操作了本帖開始我就講了如何確定基準(zhǔn)濃度，篩選濃度是基準(zhǔn)濃度的高一級(jí)，維持用篩選濃度的一半。最近的一個(gè)實(shí)驗(yàn)是：3106細(xì)胞電轉(zhuǎn)后，我把電激杯中的細(xì)胞分別接種1/4000和1/1000和1/300到24孔板中，48小時(shí)后加g418篩選，這個(gè)時(shí)候接種了1/300細(xì)胞的孔會(huì)大約50%匯合，而理論上接種了1/4000細(xì)胞的孔會(huì)4%左右匯合，今天是篩選后第9天，觀察到1/4000孔有兩三個(gè)小克隆，按道理1/300孔會(huì)有2030個(gè)克隆，但實(shí)際的情況是它們幾乎全部死光了，僅有少數(shù)存活細(xì)胞！所以我認(rèn)為匯合度對(duì)g418篩選影響很大，這耽誤了我將一個(gè)多月。我的感覺G418篩選時(shí)間太長(zhǎng)，到后來(lái)一般會(huì)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有影響。一般5～7天后G418就可以減半維持。血清濃度可以高到20％，質(zhì)量要好。一、 試劑準(zhǔn)備 HBS（Hepesbuffered saline）：876mg NaCl溶于90ml ddH2O，加入1M Hepes,補(bǔ)ddH2O至100ml, ，濾過(guò)除菌。培養(yǎng)基：含血清或不含血清的，用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞的正常培養(yǎng)。回收特異性擴(kuò)增片段，連入T載體。酶切初步鑒定，測(cè)序證實(shí)。 真核重組表達(dá)載體的構(gòu)建：pcDNA3載體帶有在大腸桿菌中復(fù)制的原核序列、便于挑選帶重組質(zhì)粒細(xì)菌