【正文】 的商品化熒光標(biāo)記試劑，被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)、低聚核苷酸等的生物熒光分析。王麗秋等[19]將對甲苯甲酸基引入吲哚環(huán)的N原子上，合成了一系列新型的水溶性吲哚菁染料。由上可以看出：對稱型水溶性吲哚線性多甲川菁染料通常是先對吲哚雜環(huán)進(jìn)行修飾，再由N原子上帶有活性甲基的取代吲哚雜環(huán)季銨鹽與縮合劑反應(yīng)得到。通常用磺酸基、羧基等來對吲哚環(huán)進(jìn)行修飾，修飾的位置主要有吲哚環(huán)的5位或吲哚環(huán)上N成鹽的位置。文獻(xiàn)中報(bào)道較多的橋鏈染料主要有兩類：一是在染料的甲川鏈上引入雜環(huán)，如呋喃環(huán)、噻吩環(huán)等；另一類是多甲川鏈中引入剛性脂環(huán)，如方酸環(huán)、茚酮環(huán)、克酮酸環(huán)、環(huán)戊(己)環(huán)及多元環(huán)等。剛性橋環(huán)多甲川吲哚菁染料根據(jù)引入的剛性橋環(huán)的不同，可以細(xì)分為方酸吲哚菁染料、中位含氯的五(六)元橋環(huán)吲哚菁染料、克酮酸吲哚菁染料等。他們對四種菁染料進(jìn)行光穩(wěn)定性研究發(fā)現(xiàn)，提高染料的光穩(wěn)定性可以采取以下三種方法：(1)在傳統(tǒng)的直鏈甲川鏈上引入環(huán)己烯；(2)以芐基溴為烴化試劑使吲哚環(huán)中的氮季銨化；(3)在甲川鏈中引入給電子基團(tuán)。從上述文獻(xiàn)可以看出吲哚菁染料引入剛性橋環(huán)后可以提高菁染料的光穩(wěn)定性，為多甲川菁染料的應(yīng)用開辟了更廣闊的天地。當(dāng)菁染料被光照以后，分子中的電子能量增加，由基態(tài)躍遷至單線激發(fā)態(tài)，當(dāng)電子由單線激發(fā)態(tài)回落至基態(tài)時(shí)，會(huì)以光的形式釋放能量，因此，該類化合物具有熒光。一般甲川鏈上每增加一個(gè)雙鍵可使染料分子的最大和不同聚集態(tài)的形成引起的。在甲川鏈上引入橋環(huán)結(jié)構(gòu)后，波長及波形都會(huì)有所改變。一般來說，多甲川類菁染料有著很強(qiáng)的吸光強(qiáng)度，超出了一般的染料。七甲川菁染料的光氧化反應(yīng)有如下特征：(1)在溶液中的光氧化反應(yīng)符合一級反應(yīng)動(dòng)力學(xué)過程；(2)當(dāng)雜環(huán)母核結(jié)構(gòu)相同時(shí)，甲川鏈越長，光穩(wěn)定性越差；(3)自敏氧化原初過程中，既存在單線態(tài)氧過程，又存在超氧負(fù)離子過程，單線態(tài)氧起主要作用；(4)光氧化反應(yīng)主要發(fā)生在與雜環(huán)母核相連的次甲基碳鏈上，氧化產(chǎn)物為醛、酮和少量的羧酸等。為提高七甲川菁染料的光穩(wěn)定性能,主要可以采用以下三種方法：(1)在甲川鏈上引入不飽和環(huán)體結(jié)構(gòu),增加光氧化反應(yīng)時(shí)的空間位阻,提高其光穩(wěn)定性能；(2)在分子中引入強(qiáng)吸電子基團(tuán), 如NO2,CN等,可降低分子的HOMO軌道的能量,增強(qiáng)其抗氧化性能；(3)將菁染料與單線態(tài)氧淬滅劑配合使用。由于第一種方法常常引起染料溶解度的下降,第二種方法易引起染料吸收光譜的藍(lán)移,因此第三種方法最為常用, 效果也最明顯。在吲哚的苯環(huán)及氮原子上的取代基上引入SO3H、COOH、OH等基團(tuán)能增加染料的水溶性。雜環(huán)氮原子上所連的基團(tuán)對介質(zhì)的物理性質(zhì)影響較大，一般在氮原子上引入長鏈或支鏈烷基能提高染料在乙醇中的溶解度。華東理工大學(xué)姚祖光等測定了雜環(huán)氮原子上不同烷基取代的系列吲哚五甲川菁染料在乙醇中的溶解度，結(jié)果與上述結(jié)論相同。TLC兼?zhèn)淞酥V和紙色譜的優(yōu)點(diǎn)，一方面適用于少量樣品(幾到幾微克，)的分離；另一方面在制作薄層板時(shí)，可把吸附層加厚加大，可用來精制樣品。此外，TLC法可用來跟蹤有機(jī)反應(yīng)，進(jìn)行柱色譜之前的一種“預(yù)試”。常用的TLC板有軟板和硬板兩種，前者是將吸附劑直接鋪在板上制成，后者是在吸附劑中加入粘合劑或溶劑，調(diào)制后涂布于板上。吸附柱色譜在玻璃管中填入表面積很大、經(jīng)過活化的粉狀固體吸附劑（固定相）硅膠，從柱頂加入樣品溶液，當(dāng)溶液流經(jīng)吸附柱時(shí)，各組分被吸附在柱的上端，然后從柱上方加入洗脫劑，由于各組分吸附能力的不同，在固定相中反復(fù)發(fā)生吸附解析再吸附再解析的過程，由于各物質(zhì)結(jié)構(gòu)的極性不同，它們隨著洗脫劑向下移動(dòng)的速度也不同，于是形成了不同的色譜帶。色譜法又稱色層法、層析法，是分離、提純和鑒定化合物的重要方法之一，它是一種物理的分離方法，其基本原理是利用混合物各組分在某一物質(zhì)中的吸附或溶解性能（分配）的不同，或其親和性能的差異，使混合物的各組分隨著流動(dòng)的液體或氣體（稱流動(dòng)相），通過另一種不動(dòng)的固體或液體（稱固定相），進(jìn)行反復(fù)的吸附或分配作用從而使各組分分離。且染料中的甲川鏈越長，染料越易分解，影響了染料的廣泛應(yīng)用，因而研究和解決普染料的光穩(wěn)定性具有十分重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義[11]。Ping Chen等證實(shí)：菁染料的褪色主要是由光氧化引起的， 它有電子轉(zhuǎn)移和能量轉(zhuǎn)移兩種機(jī)制，為一階動(dòng)力學(xué)關(guān)系[1214]。 ； Dye(1Δg) ； 1O2； Dye能量轉(zhuǎn)移過程是由染料自身的光敏化產(chǎn)生了單線態(tài)氧而破壞染料；而電子轉(zhuǎn)移過程是由染料自身的光敏化產(chǎn)生的超氧負(fù)離子氧化過程所致[5]。因此，凡是能延緩這個(gè)過程的結(jié)構(gòu)變化都將增加菁染料的穩(wěn)定性。Reda Mahmoud Abd E1Aal 給出了一個(gè)粗略計(jì)算躍遷能的公式： △Etheo=h2/8mL2(N＋1) 其中：h為普朗克常量，m 為電子質(zhì)量，L為鏈長度，N 為雙鍵個(gè)數(shù)。因此絕大多數(shù)的五甲川功能菁染料最大吸收波長都小于 700nm，真正能在近紅外領(lǐng)域發(fā)揮作用的很少。因此，超過七甲川的功能菁染料的報(bào)道幾乎沒有?？梢?，影響紅外吸收功能菁染料最大吸收波長和穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素是多甲川鏈的長度。在甲川鏈上引入不飽和環(huán)體結(jié)構(gòu)，使多甲川鏈部分剛性化，增加光氧化反應(yīng)時(shí)的空間位阻，使 1O2 和 O2 的進(jìn)攻受阻，提高其光穩(wěn)定性能。這兩方面原因使人們對橋環(huán)結(jié)構(gòu)非常重視。另有，菁染料的光穩(wěn)定性受染料的結(jié)構(gòu)、氧氣及氧濃度的大小影響。 取代基 取代基的變化是對功能菁染料進(jìn)行修飾的一個(gè)重要途徑，雖然一般認(rèn)為吸電基團(tuán)有利于降低功能染料的電子躍遷能，吸收發(fā)生紅移，但是綜合分析文獻(xiàn)可以看出：取代基的種類以所處的位置都會(huì)對功能菁染料的性質(zhì)產(chǎn)生不同的影響。在吲哚環(huán)上引入強(qiáng)吸電子基團(tuán)，如NOCN、SO3H、鹵素等，能使共軛甲川鏈上的電子云密度減少，增強(qiáng)其抗氧化性能。相對影響程度次序?yàn)椋篘02 OCH3 CH3 Cl H ，隨它們的給電子能力增強(qiáng)，染料的最大吸收波長紅移程度增加。 環(huán)境 染料在使用過程中往往是處于一定的介質(zhì)之中，因此環(huán)境對其性質(zhì)也有明顯的影響，例如，一些文獻(xiàn)中提到，溶劑的極性對功能菁染料的最大吸收波長及穩(wěn)定性都有較大的影響。W、Holzer等研究表明，功能菁染料在極性溶劑中大多以單、二聚態(tài)存在，而在非極性溶劑中則以多聚態(tài)存在，由此導(dǎo)致功能菁染料在非極性溶劑中更穩(wěn)定。 選題的依據(jù)七甲川吲哚菁染料在生物分析中可以顯著提高檢測的靈敏度；在染料敏化太陽能電池上可以拓寬光陽極的光譜吸收范圍，提高光電轉(zhuǎn)化效率。(1) 染料光穩(wěn)定性需要進(jìn)一步提高；(2) 目前七甲川菁染料多為對稱結(jié)構(gòu)，缺少單一的熒光標(biāo)記反應(yīng)活性位點(diǎn)。需要合成出不對稱菁染料，只在分子一端N位上引入一個(gè)羧基。本論文選定長波長七甲川吲哚菁染料為研究對象，在總結(jié)前人研究成果的基礎(chǔ)上，針對目前存在的問題和不足，擬完成以下工作(1) 首先合成3H吲哚啉中間體。由對氨基苯磺酸，經(jīng)重氮化、還原水解制得對肼基苯磺酸，對肼基苯磺酸在醋酸作用下與3甲基2丁酮通過Fisher合成形成腙，再經(jīng)氫氧化鉀和異丙醇回流得到2,3,3三甲基3H吲哚啉5磺酸鉀，最后由烷基化試劑對氯甲基苯甲酸使其季銨鹽化，得到染料中間體——1對羧芐基2,3,3三甲基3H吲哚啉5磺酸鉀。圖21 染料中間體的總合成路線 染料中間體的合成預(yù)處理七甲川吲哚菁染料是由兩端的吲哚環(huán)通過共軛甲川鏈連接在一起的。染料中間體的結(jié)構(gòu)決定著染料的結(jié)構(gòu)和性能，根據(jù)本論文的目標(biāo)染料的特點(diǎn)，染料中間體的結(jié)構(gòu)如圖22。中間體的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是分子中的氮原子上的取代基為對羧基芐基，其中的羧基是為下一步合成得到的目的染料提供可與生物基質(zhì)中游離氨基共價(jià)結(jié)合的基團(tuán)，并與磺酸基共同提高染料的水溶性。 染料中間體的合成方法 對氨基苯磺酸重氮鹽的合成方法 在250 mL三口燒瓶中加30 mL水，升溫至50℃， g( mol)。將溫度降至16℃后， g（ mol）亞硝酸鈉配成的25%溶液，在1622℃下反應(yīng)1 h。用約14 g30%（ mol），然后室溫下將上述重氮鹽緩慢加入，加料時(shí)間約3 min。過濾，所得固體用水重結(jié)晶后， g，收率70%。混合物在氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌回流，回流溫度約為106℃，十幾分鐘后混合物變成粉紅色的澄清液。加入丙酮，析出粉紅色產(chǎn)品固體，過濾，用乙醚洗滌三次。 2,3,3三甲基3H吲哚啉5磺酸鉀鹽的合成方法 ,3,3三甲基吲哚啉5磺酸溶解在甲醇中，然后向此甲醇溶液中滴加氫氧化鉀的異丙醇飽和溶液，逐漸有晶瑩黃色針狀沉淀定量析出。 1對羧基芐基3H吲哚啉5磺酸鉀的合成方法 2,3, g（ mol） g在鄰二氯苯12 mL中混合并加熱到110℃，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下反應(yīng)約11 h后，冷卻，移去溶劑，固體用異丙醇研磨，得到中間體固體顆粒，過濾，產(chǎn)品放入真空干燥器中保存?zhèn)溆?縮合劑的制備在冰鹽水的冰浴條件下，三氯氧磷、DMF和環(huán)己酮在二氯甲烷溶劑中進(jìn)行反應(yīng)，生成2氯1甲?；?羥甲亞基環(huán)己烯。圖23 2氯1甲?；?羥甲亞基環(huán)己烯縮合劑的合成將37 ml三氯氧磷( mol)用35 ml干燥的二氯甲烷稀釋，然后在冰浴下將其逐滴加入80 ml由干燥的二氯甲烷和DMF ( mol)1 : 1(v/v)組成的混合液中，然后再逐滴加入10 g( mol)環(huán)己酮，撤下冰浴，氮?dú)獗Ｗo(hù)，將反應(yīng)液加熱至4550 ℃，回流反應(yīng)4 h后，以冰鹽浴冷卻，然后分批倒入200 g碎冰中，冰箱中冷藏48 h，得淡黃色固體，過濾，固體以冰凍的丙酮分批洗滌至黃色。 對稱橋環(huán)Cy7的制備 對稱橋環(huán)七甲川吲哚菁染料的結(jié)構(gòu)為進(jìn)一步提高化合物的光穩(wěn)定性和染料熒光性能，本文設(shè)計(jì)的目標(biāo)染料引入六元橋環(huán)，即合成對稱中位含氯六元橋環(huán)七甲川吲哚菁染料，其結(jié)構(gòu)式如圖24。此法比較簡單，室溫下即可進(jìn)行。所用的溶劑主要有：乙醇、醋酸、醋酐或醋酸和醋酐的混合物。本章采用上行法進(jìn)行分離，選用200 ml燒杯做展開缸，分離時(shí)用大玻璃板蓋上。圖25 Cy7染料分離裝置 TLC操作一般分3個(gè)步驟：點(diǎn)樣、展開和顯色。(1) 點(diǎn)樣 首先將被檢樣品用合適的溶劑溶解，%1%濃度，最好采用與展開劑極性相近且具有高揮發(fā)度的溶劑。若同時(shí)點(diǎn)幾個(gè)樣品， cm，且在同一水平線上，以不影響檢出為宜。(2) 展開 點(diǎn)樣后，讓溶劑揮發(fā)，然后展開。溶劑有單一溶劑或多元溶劑，根據(jù)樣品吸附性及其在溶劑中的分配系數(shù)來選擇。柱色譜分離與TLC原理相同，主要用于大量有機(jī)混合物的分離。常用分離柱的填制有干法和濕法兩種。柱分離效果與洗脫劑選擇關(guān)系極大，一般根據(jù)物質(zhì)極性采用相應(yīng)極性溶劑洗脫。通過縮合劑2氯1甲?；?羥甲亞基環(huán)己烯與中間體1對羧芐基2,3,3三甲基3H吲哚啉5磺酸鉀按摩爾比1 : 2縮合得到了對稱Cy7。第3章 結(jié)果與討論 縮合劑的制備工藝探討縮合劑合成是在無水條件下進(jìn)行的，DMF沸點(diǎn)較高縮合劑是雙醛縮合物，性質(zhì)不穩(wěn)定，極易被氧化以氮?dú)獗Ｗo(hù)在冰箱中保存，使用前用冰凍的丙酮溶液洗滌至淡黃色。DMF先加入體積比10%的苯，常壓蒸餾用苯帶出過多的水，再加入干燥劑無水硫酸鎂，放置數(shù)天，減壓條件下將DMF蒸出。因?yàn)樵摲磻?yīng)是在無水條件下進(jìn)行，所有儀器和藥品均必須干燥。若滴加速度過快，攪拌不均勻，反應(yīng)放熱容易造成局部過熱，從而造成副產(chǎn)物增多。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)的用量，三氯氧磷、環(huán)己酮的滴加速度應(yīng)控制在510s/滴，溫度控制在0186。C 染料中間體的制備工藝探討 對氨基苯磺酸是一種兩性有機(jī)物，酸性比堿性強(qiáng)，能與堿形成鹽，但不與酸作用。加入鹽酸，一方面使亞硝酸鈉生成亞硝酸，另一方面使對氨基苯磺酸鈉分解為對氨基苯磺酸，產(chǎn)生細(xì)粒狀沉淀析出，并立即與亞硝酸發(fā)生重氮化反應(yīng)，生成對氨基苯磺酸的重氮鹽。重氮鹽制備一般需要在05 ℃的低溫下進(jìn)行。為了增大重氮鹽的熱穩(wěn)定性，使反應(yīng)溫度高于一般重氮化溫度，本實(shí)驗(yàn)引入磺酸基。為使對氨基苯磺酸完全重氮化，在反應(yīng)過程中必須不斷地?cái)嚢琛?shí)驗(yàn)結(jié)果表明，25%的亞硝酸鈉溶液滴加速度應(yīng)控制在110 g/min。可用淀粉碘化鉀試紙檢驗(yàn)亞硝酸是否過量。若亞硝酸過量，可向溶液中加入少量尿素去除亞硝酸，至溶液不再冒氣泡。該反應(yīng)以亞硫酸氫鈉為還原劑，控制溶液pH在6左右，若pH太低，亞硫酸鈉分解為二氧化硫，pH太高，重氮鹽以重氮堿形式存在，影響產(chǎn)率。產(chǎn)物經(jīng)重結(jié)晶提純，為白色針狀晶體，空氣中易氧化，顏色變?yōu)榈壬?。目前其合成方法有：Fisher 吲哚合成，采用N甲?；鵶甲基苯胺為原料的Madelung法，采用s硝基甲苯和二甲基甲酰胺縮醛為原料的BatchoLeimugruber合成，采用s硝基芐基酮為原料的還原環(huán)化和采用N鹵代苯胺為原料的Gassman合成等。Fisher吲哚合成主要在酸或金屬和無水金屬鹽催化劑作用下，使醛、酮或酮酸類(含a亞甲基)的芳腙衍生物分子內(nèi)縮合、重排及脫氮環(huán)化形成吲哚環(huán)化合物。本實(shí)驗(yàn)采用一鍋法合成，即在醋酸介質(zhì)中回流，不經(jīng)分離中間產(chǎn)物腙，原位環(huán)化脫氨制得2,3,3三甲基吲哚啉5磺酸。但反應(yīng)還有副產(chǎn)物吲哚啉的產(chǎn)生?；撬峄鶊F(tuán)中的氫離子對閉環(huán)反應(yīng)起到催化作用，有利于副產(chǎn)物吲哚啉的生成。醋酸鈉在一定程度上使氨基對位的磺酸基離子化，減小了其吸電子的能力，激活了被鈍化的氮原子，提高了親核反應(yīng)活性。圖32 2,2,3三甲基3H吲哚啉5磺酸鉀鹽的制備方法由2,3,3三甲基3H吲哚啉5磺酸合成其磺酸鉀鹽時(shí)，加熱回流，溶液顏色變?yōu)辄S色，說明反應(yīng)速度較快。 N對羧芐基3H吲哚啉5磺酸鉀的合成親電試劑可向吲哚環(huán)中的富電子的N原子進(jìn)攻，使其季銨鹽化。對氯甲基苯甲酸是芐基鹵代烴，反應(yīng)活性高，使烷基化反應(yīng)條件相對溫和，染料中間體容易合成。針對反應(yīng)原料及反應(yīng)條件的特點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)選用高沸點(diǎn)的鄰二氯苯為溶劑，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下于110℃下恒溫反應(yīng)，時(shí)間為11 h。 g縮合