【正文】 ............................................46 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) ................................................................................47 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) ................................................................................47 DPPH 清除率的測定方法 .................................................................47 中紅外光譜（MIR）分析 .................................................................48 數(shù)據(jù)處理與分析方法 ........................................................................48 結(jié)果與分析 ................................................................................................48 PEF 的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果 ....................................................................48 PEF 的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果 ....................................................................50 MIR 分析結(jié)果 ....................................................................................53 討論 ............................................................................................................53 本章小結(jié) ....................................................................................................54第 7 章 結(jié)論 ........................................................................................................55 全文結(jié)論 ....................................................................................................55 創(chuàng)新點(diǎn) ........................................................................................................56參考文獻(xiàn) ................................................................................................................58導(dǎo)師簡介 ................................................................................................................64作者簡介 ................................................................................................................65在學(xué)期間所 取得的科研成果 ................................................................................66致 謝 ................................................................................................................68英文縮略詞表英文縮寫 英文名稱 中文名稱DH Degree of Hydrolysis 水解度SPSS Statistical Package for Social Science 社會科學(xué)統(tǒng)計(jì)軟件包OFAT Onefactoratatime 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)RSM Response Surface Methodology 響應(yīng)面分析法BBD BoxBehnken Design BoxBehnken 設(shè)計(jì)SD Standard Deviation 標(biāo)準(zhǔn)差DPPH 1,1diphenyl2picrylhydrazyl 1,1二苯基 2三硝基苯肼CAPS Corn Antioxidative Peptides 玉米抗氧化肽LD Low Dose 低劑量MD Middle Dose 中劑量HD High Dose 高劑量GSHPx Glutathione Peroxidase 谷胱甘肽過氧化物酶SOD Super Oxide Dismutase 超氧化物歧化酶MDA Malondialdehyde 丙二醛CAT Catalase 過氧化氫酶PEF Pulsed Electric Field 高壓脈沖電場EWAPS Egg White Antioxidative Peptides 蛋清抗氧化肽MIR Midinfrared 中紅外光譜分析第 1 章 緒論 1第 1 章 緒論 玉米蛋白粉的綜合利用現(xiàn)狀分析玉米是我國的傳統(tǒng)糧食作物，分布范圍廣，營養(yǎng)價(jià)值豐富，2022 年產(chǎn)量已超過 億噸，而且種植面積將繼續(xù)擴(kuò)大。近年來，我國玉米深加工行業(yè)取得了飛速發(fā)展，一系列玉米加工副產(chǎn)物在我國食品工業(yè)和畜牧業(yè)中的地位也越來越重要，玉米蛋白粉即屬于其中之一。但是由于玉米蛋白粉的水溶性差、口感粗糙、利用率低、營養(yǎng)價(jià)值低等不足，限制了其在食品工業(yè)中的應(yīng)用，大多被用于飼料或作為廢棄物排掉 [3]。 玉米蛋白粉的組成玉米蛋白粉中含蛋白質(zhì) 60 %左右，含淀粉 20 %，以及少量的纖維素和維生素 A，通常含 15 種無機(jī)鹽和玉米黃色素 [4,5]?？扇苄缘鞍踪|(zhì)在機(jī)體內(nèi)分解、轉(zhuǎn)化，表現(xiàn)出一定的生理功能性；不可溶性蛋白質(zhì)易和大分子有機(jī)物或微量元素結(jié)合，不易被機(jī)體吸收利用。所以如何改良淀粉和蛋白質(zhì)特性是玉米蛋白粉精深加工的主要研究問題。醇溶蛋白可溶于 70 % 80 %的乙醇，谷蛋白可溶于稀酸或稀堿，球蛋白不溶于水但溶于鹽，白蛋白又稱清蛋白，可溶于水 [8]。由于這種獨(dú)特的氨基酸組成，造成玉米蛋白粉的營養(yǎng)價(jià)值不高，但是通過生物工程和化學(xué)技術(shù)可以對玉米蛋白粉進(jìn)行二次利用。 玉米蛋白粉的應(yīng)用現(xiàn)狀（1）用作飼料蛋白原料玉米蛋白粉不含有毒有害物質(zhì)，可以直接作為飼料蛋白原料。飼喂玉米蛋白粉的蛋雞產(chǎn)蛋率可提高 15 %左右，能夠防治蛋雞的軟骨病和其他疾病，有助于提高蛋白品質(zhì)。（2）制備谷氨酰胺肽谷氨酰胺是一種氨基酸類藥物，可用于治療胃腸性疾病和免疫性疾病。當(dāng)機(jī)體內(nèi)谷氨酰胺含量不足時(shí)，可以通過體外的谷氨酰胺肽進(jìn)行補(bǔ)給，利用低價(jià)值的玉米蛋白粉制備高價(jià)值的谷氨酰胺肽是玉米蛋白粉深加工一條新途徑 [11]。利用成膜性，玉米醇溶蛋白還可作為藥物制劑的輔料。也有研究應(yīng)用超聲波技術(shù)和萃取技術(shù)，并優(yōu)化獲得醇溶蛋白的提取工藝，可以提高生產(chǎn)效率 [12]。適宜的蛋白酶水解條件和酶解物處理能夠提高玉米黃色素得率，增效劑的配合使用能夠影響玉米黃色素的光密度值 [13]。而且玉米蛋白粉的酶解溫度、水解時(shí)間和 pH 值也會影響玉米黃色素的提取率 [15]。高 F 值低聚肽的消化吸收性優(yōu)于蛋白質(zhì)與氨基酸，可以作為腸道營養(yǎng)劑。第 1 章 緒論 3玉米蛋白粉具有獨(dú)特的氨基酸組成，能夠滿足血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）抑制肽的氨基酸特征，可制備獲得降血壓肽 [16,17]。國內(nèi)外研究表明，玉米源抗氧化肽的活性受酶解條件、蛋白酶種類和底物特性的影響較大。王雙玉研究報(bào)道，底物濃度為 8 %，[E]/[S]為 2 %，pH 值為 ，時(shí)間為 3 h，溫度為 55 ℃時(shí)，玉米抗氧化肽對氧自由基（O 2?）和羥自由基（? OH）具有很強(qiáng)的清除能力 [20]。 材料與設(shè)備 材料與試劑玉米蛋白粉（經(jīng) 180 目篩選，蛋白質(zhì)含量 %）：購買于長春大成集團(tuán)；1,1二苯基 2三硝基苯肼（1,1diphenyl2picrylhydrazyl, DPPH）：分析純，購買于Sigma 公司；堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶（酶活 20 萬 U/g）：食品級，購買于南寧龐博生物工程有限公司；甲醇、氫氧化鈉、鹽酸：均為分析純，購買于北京化工廠。 實(shí)驗(yàn)方法 玉米蛋白粉的酶解方法 水解度測定方法水解度（DH）是衡量水解反應(yīng)中，蛋白質(zhì)水解達(dá)到平衡后肽鍵被酶切斷的情況，通過測定水解度可以優(yōu)選最適宜蛋白酶和最佳酶解條件。底物蛋白在不同 pH 環(huán)境下解離狀態(tài)不同，酶解后可以產(chǎn)生自由羧基、氨基和氨基酸殘基，所釋放的氨基酸能改變酶解液 pH 值，用 1M 的 NaOH 或 HCl 滴定回原 pH 值，根據(jù)計(jì)量消耗的酸液或堿液體積，即可知道肽鍵被酶切斷的數(shù)目，計(jì)算得到單位質(zhì)量蛋白質(zhì)中被酶解的肽鍵數(shù)占總肽鍵數(shù)的百分比即為水解度 [53]，計(jì)算公式如下： …………………………（公式 ） ；toptohV CDH (%)= 10Mhα???????? ?式中：h—被水解的肽鍵數(shù)；V—酸或堿的滴定量 (mL)；C—酸或堿的濃度 (mol/L)；Mp—參加水解的蛋白質(zhì)總量 (g)；htot—每克蛋白質(zhì)中肽鍵的克當(dāng)量數(shù)（對于玉米蛋白取 mmol/g） ；α—氨基酸的平均離解度。由于酶解溫度、pH 值和酶與底物濃度比三個(gè)因素對酶解效果和產(chǎn)物的影響較為顯著 [54]。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果和 BBD 中心組合實(shí)驗(yàn)原理，為最優(yōu)蛋白酶設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn) [55]。自變量 X1（酶解溫度） 、X 2（酶解 pH 值） 、X 3（[E]/[S]）的三個(gè)水平編碼表如表 ，回歸方程的二次模型如下： 33230111jj ijjijy?????????式中：y 是響應(yīng)值； β0是截距， βj、β jj和 βij分別代表線性、平方和交互作用系數(shù)；X i和 Xj代表自變量。 場發(fā)射電子掃描實(shí)驗(yàn)利用場發(fā)射掃描電子顯微鏡（JSM6700F ，JEOL 日本電子公司）對輻照處理前后的玉米蛋白粉進(jìn)行電鏡掃描，可以反映輻照處理對玉米蛋白粉表面微觀結(jié)構(gòu)的影響。標(biāo)準(zhǔn)偏差（x 177。 結(jié)果與分析 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果以 DH 作為衡量指標(biāo)，對溫度 T（℃） 、pH 值和酶比底物濃度 [E]/[S]（%）三個(gè)因素影響三種蛋白酶的酶解效果情況匯總分析，結(jié)果如圖 所示。第 3 章 高活性玉米抗氧化肽（CAPS1 ）的優(yōu)選8（a）堿性蛋白酶（b）中性蛋白酶（c）木瓜蛋白酶圖 酶解溫度對 DH 的影響Figure Effects of temperature on DH注：不同小寫字母代表差異性顯著（P）。 %，繼續(xù)升高至 65 ℃時(shí)，DH 顯著下降（P） 。 %，隨著溫度繼續(xù)升高，DH 逐漸下降。 %。 %，符合堿性蛋白酶的應(yīng)用 pH 環(huán)境，所以選擇 pH 值為 9 進(jìn)行之后的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。 %，可以選取 pH=7 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 %。（3）酶比底物濃度對 DH 的影響酶比底物濃度對酶解物 DH 的影響如圖 所示，由圖 （a）可知，堿性蛋白酶酶解物隨著[E]/[S]的增加 DH 顯著增加（P） ，在[E]/[S]為 12 %時(shí)達(dá)到最大值 177。中性蛋白酶的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖 （b）所示，[E]/[S]的增加對 DH 的影響為先增加后降低。 %。 %。第 3 章 高活性玉米抗氧化肽（CAPS1 ）的優(yōu)選12（4）單因素實(shí)驗(yàn)的最優(yōu)工藝參數(shù)根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，堿性蛋白酶酶解物的水解度高于其他兩種酶，因此堿性蛋白酶可以作為水解玉米蛋白的最優(yōu)蛋白酶，三種酶的單因素實(shí)驗(yàn)最優(yōu)工藝參數(shù)如表 所示：表 單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化工藝參數(shù)Table Optimized independent levels of OFAT酶種類 酶解溫度（℃） 酶解 pH 值 [E]/[S] (%)堿性蛋白酶 60 9 12中性蛋白酶 30 7 10木瓜蛋白酶 60 9 10 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選用堿性蛋白酶水解玉米蛋白粉，以 DH 為指標(biāo)，考察酶解溫度，酶解 pH 值和[E]/[S] 對 DH 的影響情況，進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面 BBD 實(shí)驗(yàn)，設(shè)計(jì)方案和結(jié)果如表 所示。對響應(yīng)值 DH 的三元二次回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表 所示：回歸模型是顯著的（P ） ，回歸模型的決定系數(shù)為 ，說明該模型能夠解釋 %的變化，因此可用此模型對三個(gè)影響因素進(jìn)行分析，對實(shí)踐具有指導(dǎo)意義。 R2=。 predicated R2=。通過分析等高線能夠反映溫度、 pH 值和酶比底物濃度的交互作用，確定相應(yīng)值，達(dá)到即能制備