【正文】 溝中存在多余的氫鍵給體和受體，這些氫鍵給體和受體可以和專一的結(jié)合分子(如蛋白質(zhì)) 發(fā)生相互作用，形成專一的復(fù)合物，也可以與單鏈DNA分子結(jié)合形成三螺旋DNA。三螺旋DNA 的組成結(jié)構(gòu)基元是三堿基體，這些堿基體也具有專一性，具體體現(xiàn)在T、C、G、A 分別要接在AT、GC、GC 和AT 堿基對(duì)上（見圖 16） 。因而合成能抗核酸酶能力強(qiáng)、水溶性和脂溶性適當(dāng)、毒副作用小的寡聚核苷酸片段和提高三螺旋DNA穩(wěn)定性的主鏈修飾方法仍是目前的研究熱點(diǎn)。這些區(qū)域包括端粒末端G重復(fù)序列，以及一些重要基因的啟動(dòng)子區(qū)域，因此G 四鏈體的形成或拆散可能涉及到體內(nèi)的一些重要生理過程的調(diào)控，比如細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和腫瘤形成等。因此，研發(fā)與G四鏈體相互作用的小分子抗癌藥物受到了廣泛的關(guān)注。由于富G DNA中的G 殘基都是成串排列的，因此，當(dāng)四條或四段富G單鏈DNA的G殘基并肩形成Hoogsteen堿基配對(duì)時(shí)，就形成了一個(gè)由4個(gè)G 殘基的雜環(huán)平面聯(lián)合形成的Gquartet 平面。由于這段四鏈體是以 G殘基為主形成的，故稱為 Gquadruplex。在兩個(gè)相鄰的四堿基體的中央會(huì)形成一個(gè)空腔，空腔內(nèi)有負(fù)電性的羰基氧存在，使得此處易于結(jié)合陽離子。 Gquadruplex特殊結(jié)構(gòu)使得它能夠成為特異性的DNA靶點(diǎn)。G四鏈體 DNA 可以通過單鏈，雙鏈以及四鏈形成三種不同的四螺旋結(jié)構(gòu)，每種結(jié)構(gòu)又有多種異構(gòu)體（見圖 18）。現(xiàn)在普遍認(rèn)為通過控制適當(dāng)?shù)臈l件，如溫度、DNA 濃度、緩沖液中的 Na+和 K+的濃度等可以改變 G四鏈體的構(gòu)型。20世紀(jì)三四十年代，Hermann Muller 和Barbara McClintock 同時(shí)提出了端粒的概念。端粒的主體是雙螺旋結(jié)構(gòu)，富GT鏈與富CA 鏈配對(duì)，但3 ’末端突出為一段單鏈懸掛。端粒是真核細(xì)胞染色體末端的一種特殊的核蛋白復(fù)合體，由高度重復(fù)序列的端粒 DNA 和端粒結(jié)合蛋白組成 [17]。人的端粒約有15 kb 反復(fù)串聯(lián)的TTAGGG 構(gòu)成的，并且以50200bp／次分裂進(jìn)行縮短，主要組成部分為515 kb 長的雙鏈DNA 和3′末端100200 bp 長的G 單鏈懸垂(Goverhang)DNA。這段單鏈在名為Shelterin [18]/Telosome[19]的蛋白結(jié)構(gòu)催化下折回到端粒內(nèi)部雙鏈，并將該端區(qū)域的一段自身鏈置換出來，取而代之與互補(bǔ)鏈配對(duì)，形成Tloop (telomere loop)結(jié)構(gòu)，而3’末端單鏈被“包埋”在Tloop中，端粒末端便形成了一個(gè)與外界隔絕的閉合結(jié)構(gòu)。同時(shí)，這種結(jié)構(gòu)也使端粒酶不可能持續(xù)與端粒3’末端單鏈發(fā)生作用，從而保證了端粒長度的恒定。端粒的長短在細(xì)胞癌變和衰老中起著重要作用。1985 年Greider 和Blackburn 首次從四膜蟲細(xì)胞提取液合成端粒的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)了端粒酶活性并同時(shí)證實(shí)了端粒酶具有維持端粒長度的作用。端粒酶由三個(gè)部分組成，包括端粒酶RNA(hTR) ，逆轉(zhuǎn)錄酶催化亞基 (hTERT)和端粒酶其它聚合蛋白 (TEP1)[2]，端粒酶的生物功能是合成染色體末端的端粒，是一種依賴于RNA 的特殊的DNA 聚合酶，屬于逆轉(zhuǎn)錄酶類型。但是在大部分腫瘤細(xì)胞(85％)中，端粒酶則表現(xiàn)出了很高的活性，而在癌周圍組織和正常組織中端粒酶幾乎是沒有活性的。而在腫瘤細(xì)胞中，端粒酶的活性被激活，使得它可以維持端粒的長度，從而維持腫瘤的繼續(xù)分裂、增殖和生長，因此這個(gè)細(xì)胞不能進(jìn)入正常的老化和衰亡，從而獲得一種永生性。因此，以抑制端粒酶活性為目標(biāo)的腫瘤基因治療研究已成為一種新的藥物作用靶點(diǎn)，而且極有希望成為最安全、有效的治療腫瘤的理想途徑。靶向端粒酶集中在以下三個(gè)方面：第一個(gè)方面以端粒酶 RNA 為靶點(diǎn)，第二個(gè)方面是抑制端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶活性，第三個(gè)方面是 G四鏈體的穩(wěn)定劑，第四個(gè)方面是開發(fā)端粒酶抑制劑的新靶點(diǎn)。由此，以 Gquadruplex 為靶點(diǎn)來尋求能夠誘導(dǎo)、穩(wěn)定或識(shí)別四鏈體結(jié)構(gòu)的小分子是當(dāng)前研究開發(fā)抗腫瘤藥物重要途徑之一。共 32 頁 第 9 頁┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊裝┊┊┊┊┊訂┊┊┊┊┊線┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊圖 G四鏈體與端粒、端粒酶和腫瘤的關(guān)系示意圖 本文所做的工作本文將合成一種順鉑配合物，用熒光光譜、紫外光譜觀察金屬配合物與DNA的G四鏈體的鍵合作用及性質(zhì)。（2）合成鉑配合物（3）對(duì)所合成的配合物進(jìn)行核磁與質(zhì)譜檢測。共 32 頁 第 10 頁┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊裝┊┊┊┊┊訂┊┊┊┊┊線┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊2 理論部分 配合物與 DNA 作用的基本形式作用于G 四鏈體的小分子配體是通過識(shí)別和穩(wěn)定G 四鏈體而抑制端粒酶活性的，研究表明，小分子配體和不同結(jié)構(gòu)的G四鏈體結(jié)合模式不同。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，小分子配體與G 四鏈體的作用模式主要有兩種:外部堆積模式和插入模式(如圖21 所示)。即小分子配體和 Gquadruplex 的末端 G四鏈體形成共軛結(jié)構(gòu)；2) 插入模式。通過氫鍵和靜電作用于溝槽、Loop 上。總的來說，插入模式由于只有一部分堿基和配體結(jié)合，易失衡，從而導(dǎo)致整個(gè)Gquadruplex結(jié)構(gòu)的分解。圖 21 小分子與 G四鏈體的作用模式(a)外部堆積模式(b)插入模式(c)非特異性結(jié)合 DNA 與配合物作用的研究方法 光譜學(xué)方法 紫外可見光譜或電子光譜由于比較靈敏、直觀、方便，它是研究金屬配合物與DNA作用最常用的方法之一。吸收光譜是研究配合物與DNA 相互作用比較直接的一種方法。依據(jù)電子躍遷的機(jī)制，可將配合物的電子吸收光譜分為三種類型：共 32 頁 第 11 頁┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊裝┊┊┊┊┊訂┊┊┊┊┊線┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊1）以金離子Mn+ 為中心的dd 躍遷所產(chǎn)生的配位躍遷光譜；2）配體至金屬或金屬離子（LMCT ）或金屬離子至配體（MLCT ）的電荷遷移光譜，簡稱荷移光譜；3）以配體L 為中心的配體間的電子轉(zhuǎn)移光譜（ IL） 。核酸分子由于其嘌呤和嘧啶堿基具有共軛雙鍵體系，所以在紫外區(qū)260290 nm 處有特征的吸收，這種吸收隨分子中各堿基的種類、所占比例以及堿基間的堆積方式等的改變而有所不同。因此，我們可利用紫外吸收光譜對(duì)上述各核酸分子結(jié)構(gòu)的形成進(jìn)行初步判斷。 熒光光譜熒光光譜法是研究小分子與核酸相互作用的主要手段。配合物以插入方式與 DNA 作用后，由于它的振動(dòng)模式受到抑制，或免受水分子的淬滅，配合物受到了 DNA 堿基疏水環(huán)境的保護(hù)，其發(fā)光強(qiáng)度一般會(huì)增強(qiáng)。 圓二色譜及 DNA 解旋技術(shù)圓二色譜可以檢測有無旋光物質(zhì)的存在 [51，52] ，或比較左、右旋物質(zhì)的混合物中哪種含量更多，測定透析后的配合物的 CD 光譜，還可幫助確定配合物與 DNA 的相互作用有無異構(gòu)選擇性。加入配合物后，會(huì)使其吸收峰發(fā)生移動(dòng)并改變其強(qiáng)度，明顯影響 G四鏈體的 CD 光譜。又由于 CD 光譜法靈敏度高，樣品在很低的濃度下就可以檢測到特征吸收，圓二色譜成為一個(gè)很有效的檢測手段。DNA 的變性指 DNA 分子由穩(wěn)定的雙螺旋結(jié)構(gòu)松解為無規(guī)則線性結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象。配合物與 DNA 作用方式不同，則 DNA 熔化溫度(Tm)變化程度就不同。 其他光譜法線二色譜(LD) 和電二色譜 (ED)：線二色譜和電二色譜都是采用與固定光軸方向 (在流動(dòng)梯度體系中旋轉(zhuǎn)和外加電場，使 DNA 螺旋軸取向固定)平行或垂直的平面偏振光，測量結(jié)合 DNA 后的配合物對(duì)垂直和平行于 DNA 的線偏振光的不同吸收。共 32 頁 第 12 頁┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊裝┊┊┊┊┊訂┊┊┊┊┊線┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊ 流體力學(xué)方法應(yīng)用流體力學(xué)技術(shù)測試 DNA 雙螺旋長度變化。 密度泛函計(jì)算與分子模擬密度泛函理論能夠很好地考慮到體系中電子的相對(duì)能量，特別適合于單線態(tài)金屬配合物的計(jì)算。密度泛函理論的計(jì)算對(duì)于科學(xué)家們設(shè)計(jì)新的功能獨(dú)特的配合物有著重要的理論指導(dǎo)意義。共 32 頁 第 13 頁┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊裝┊┊┊┊┊訂┊┊┊┊┊線┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊3 實(shí)驗(yàn)部分 引言本章介紹了鉑多吡啶配合物的合成步驟，及其配合物的表征?，F(xiàn)列出實(shí)驗(yàn)步驟，以供參考、指正，預(yù)防此后的科研出現(xiàn)不必要的重復(fù)工作。 藥品和儀器 實(shí)驗(yàn)試劑試劑名稱 純度級(jí)別 生產(chǎn)廠家或提供商1，10鄰菲咯啉 AR 國藥鹽酸羥胺 AR 國藥甲醇 AR 國藥氯仿 AR 國藥鈀碳催化劑 AR 國藥丙酮 AR 國藥乙醇 AR 國藥氫氧化鉀 AR 國藥濃硫酸 AR 國藥石油醚 AR 國藥氫氧化鈉 AR 國藥二甲基甲酰胺 AR 國藥乙二醇 AR 國藥四氯合鉑（Ⅱ）酸鉀 AR 國藥乙二胺 AR 國藥乙二醇 AR 國藥六氟磷酸銨 98% 阿拉丁乙醚 AR 國藥氯化鉀 AR 國藥氯化鈉 AR 國藥Tris 堿 AR 國藥 實(shí)驗(yàn)儀器核磁共振波譜 Brucker 400M 核磁共振波譜儀記錄；電噴霧質(zhì)譜（ESMS）用 LCMS2022A 型液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀；高純水用 SZ97 自動(dòng)三重蒸餾水發(fā)生器獲得；共 32 頁 第 14 頁┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊裝┊┊┊┊┊訂┊┊┊┊┊線┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊電子吸收光譜用 Lambda Bio 40 紫外分光光度計(jì)測量； 熒光光譜用 Hitachi FP7000 熒光光度計(jì)測量。抽濾得淺黃色固體，用冰水洗滌三次以上，所得產(chǎn)物在 50℃干燥后備用。2）5氨基6硝基鄰菲羅啉 NNNO2NH2OHClK(Et)NNNO2NH2MolecularWeight: MolecularWeight:240.將 4g（）5硝基6氨基鄰菲羅啉溶于 100mL 無水乙醇并加熱回流，待反應(yīng)物全溶之后加入 8g（）鹽酸羥胺，此時(shí)析出淺黃色懸浮固體，并在 45 分鐘之內(nèi)，往上述混合液中滴加 KOH 的乙醇溶液（9g KOH 溶于 100mL 無水乙醇） ，反應(yīng)混合物逐漸變?yōu)樽攸S色。3）5，6二氨基鄰菲羅啉共 32 頁 第 15 頁┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊裝┊┊┊┊┊訂┊┊┊┊┊線┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊NNNO2NH2N2H42OPd/CNNNH2NH2MolecularWeight:240. MolecularWeight:將 5硝基6 氨基鄰菲羅啉溶于 400mL 無水乙醇，加熱回流至全溶，再加 Pd/C 催化劑（10% Pd）攪拌混合均勻，并在 15min 之內(nèi)逐滴加入 4mL 水合肼（80% ） 。產(chǎn)率 68%。反應(yīng)結(jié)束后，冷卻抽濾，所得固體用溫甲醇洗滌，干燥，產(chǎn)物黃綠色絮狀固體，凈重 ，產(chǎn)率 57%。因時(shí)間關(guān)系，沒有對(duì)其進(jìn)行再次的純化。將其自然冷卻至室溫，避光放置過夜。最后得紅棕色粉末固體 ，產(chǎn)率：%。待反應(yīng)完成后，加少量水稀釋，過濾出不溶物(為反應(yīng)的配體) ，向?yàn)V液中加入NH4PF6 飽和溶液，產(chǎn)生沉淀，靜置一夜后，用慢速濾紙(因沉淀顆粒太小) 兩層進(jìn)行過濾。共 32 頁 第 16 頁┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊裝┊┊┊┊┊訂┊┊┊┊┊線┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊3)[(dpqdf)Pt(en)](PF6)2 的表征圖 31 [(dpqdf)Pt(en)](PF6)2 的 1H NMR 譜共 32 頁 第 17 頁┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊裝┊┊┊┊┊訂┊┊┊┊┊線┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊圖 [(ptap)Pt(en)](PF6)2 的質(zhì)譜示意圖 不同輔助配體的多吡啶配合物與 G四鏈體 DNA 的相互作用的研究 緩沖溶液的配制緩沖溶液用高純水配制緩沖溶液 1：100mM KCl，10mM Tris，pH=7緩沖溶液 2：100mM NaCl， 10mM Tris，pH=7