【正文】 ┊線┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊ 第一代主要鉑類抗癌藥物的結(jié)構(gòu) 第二代主要鉑類抗癌藥物的結(jié)構(gòu) 第三代鉑類抗癌藥物結(jié)構(gòu)目前鉑類配合物研究的方向是:尋找比順鉑和卡鉑療效更好，不良反應(yīng)更小，藥學(xué)特性得到改善的化合物、擴(kuò)大抗癌譜、開(kāi)發(fā)與順鉑和卡鉑無(wú)交叉耐藥性的新型藥物。作為鉑類配合物的對(duì)照物，釕配合物很早就被運(yùn)用于抗腫瘤實(shí)驗(yàn)。共 32 頁(yè) 第 0 頁(yè)┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊裝┊┊┊┊┊訂┊┊┊┊┊線┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊基于順鉑抗癌藥物的合成及 DNA 鍵合性質(zhì)的研究【摘要】 癌癥是嚴(yán)重威脅人類健康和生命的常見(jiàn)病和多發(fā)病，已經(jīng)成為人類死亡的第二大病因。與順鉑相較，釕配合物毒性相對(duì)較小，在生物體內(nèi)易于吸收，也易于代謝而且釕配合物有在腫瘤組織中發(fā)生聚集的特點(diǎn)，能夠與DNA 分子以共價(jià)鍵或者非共價(jià)鍵(靜電結(jié)合、溝面結(jié)合和插入結(jié)合) 方式締合。 核酸的組成與結(jié)構(gòu) 概述構(gòu)成生命物質(zhì)的兩類主要大分子是蛋白質(zhì)和核酸。核苷酸中的堿基分為嘌呤和嘧啶兩類。改變一定的外界環(huán)境條件，如溫度、相對(duì)濕度、鹽的濃度以及有機(jī)溶劑等可以使這些構(gòu)型進(jìn)行相互的轉(zhuǎn)化，并且這些轉(zhuǎn)變從本質(zhì)上都是改變核酸分子的內(nèi)在運(yùn)動(dòng)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。其中每個(gè)G 堿基既是氫鍵的受體，又是氫鍵的給體，他們?cè)诮Y(jié)構(gòu)上是等價(jià)的。端粒的主體是雙螺旋結(jié)構(gòu)，富GT 鏈與富CA 鏈配對(duì)，但3′末端突出為一段單鏈懸掛。端粒酶抑制劑的研究主要針對(duì)其不同的組分及不同的結(jié)構(gòu)，由于 G四螺旋能阻斷 RNA 聚合酶，因此當(dāng)基因密碼區(qū)的富含 G 重復(fù)序列形成 G四螺旋而又不易解聚時(shí)，會(huì)起到抑制 RNA聚合酶的作用，從而引起早期轉(zhuǎn)錄的停止。由于溶液中小分子配體G四鏈體之間的結(jié)合處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，導(dǎo)致NMR圖譜很難解析，因此，關(guān)于復(fù)合物的NMR結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)非常缺乏，給研究小分子配體的結(jié)合模式帶來(lái)了困難。并根據(jù)強(qiáng)度的變化來(lái)判斷與 DNA 作用的強(qiáng)弱。由于密度泛函方法考慮了電子相關(guān)，計(jì)算速度快，并且能有效地估算配合物的分子結(jié)構(gòu)、電子結(jié)構(gòu)及其與 DNA 相互作用的前線分子軌道，引起了理論化學(xué)家的注意。4）雙呋喃基 dpqdf 的合成NNNH2NH2OOOO NNNNOOChemicalForula::12H0N4MolecularWeight::℃2d5，6二氨基1，10 鄰菲羅啉（，） ，2，2’雙呋喃二酮（， ） ，溶于 20mLDMF 置于 100mL 三頸瓶中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下回流 2 天。） ，分別溶于緩沖液 1 及緩沖溶液 2 中，緩沖溶液 476uL，密封加熱到 90℃，并保持 5 分鐘。從圖中可以看出，對(duì)于K +緩沖條件下，以 MLCT 峰看，配合物與DNA 作用后的減色率比在Na +緩沖條件下的減色率大。共 32 頁(yè) 第 23 頁(yè)┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊裝┊┊┊┊┊訂┊┊┊┊┊線┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊0 2 4 6 coration/uM圖 47 DNA 滴定鉀離子緩沖溶液配合物 2 在 450nm 左右的吸收峰滴定趨勢(shì)圖，[Ru]=10uM,450nm左右的吸收峰變化是由于DNA濃度的增加(從0,1,2,3,4,5μM)。共 32 頁(yè) 第 25 頁(yè)┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊裝┊┊┊┊┊訂┊┊┊┊┊線┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊50506065070750800501015020250IntesityWavelngth/nm DNA 10uL合1 2 30uL1 4合 50uL1 6 70uL合1 8 90uL1圖 410 納離子緩沖液中，配合物 1 與 Gquadruplex 作用的熒光滴定曲線，[Ru]=10uM，600nm左右的吸收峰變化是由于配合物1 濃度的增加 (從0,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10μM)。（2）細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，研究配合物對(duì)腫瘤細(xì)胞中端粒的抑制效果（3）本文說(shuō)明[(ptap)Pt(en)](PF 6)2 的合成是可行的，下一步工作在于對(duì)其進(jìn)行提純，進(jìn)行分析師譚，探討其余 G四鏈體的作用機(jī)制。共 32 頁(yè) 第 26 頁(yè)┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊裝┊┊┊┊┊訂┊┊┊┊┊線┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊5050606507075080202040608010120140160180IntesityWavelngth/nm DNA 10uL合1 2 30uL1 4合 50uL1 6 70uL合1 8 90uL1圖412 鈉離子緩沖液中，配合物2與Gquadruplex作用的熒光滴定曲線，[Ru]=10uM，600nm左右的吸收峰變化是由于配合物1 濃度的增加 (從0,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10μM)。 釕配合物對(duì)端粒 G四鏈體與 DNA 作用強(qiáng)度的研究人類的端粒含有重復(fù)銜接的雙鏈DNA 序列(5 ′ TTAGGG): (5 ′CCCTAA) 。30 40 5001absWavelngth/nm 合 5uL DNA 10 5uL A 20 DN 5uL A 圖41 鉀離子緩沖溶液配合物1 與端粒Gquadruplex作用的紫外滴定曲線,[Ru]=10uM,450nm左右的吸收峰變化是由于DNA濃度的增加(從0,1,2,3,4,5μM)。濃度確定：用紫外分光光度計(jì)測(cè)量 DNA 在 260nm 的吸光度值 A260。 鉑配合物的合成對(duì)于鉑配合物的合成，設(shè)計(jì)了如下一種，并對(duì)其進(jìn)行了合成。此外，還有 pH 滴定、熱力學(xué)方法和電化學(xué)方法等，不過(guò)這些方法在研究小分子化合物與DNA 鍵合機(jī)理方面不太常用。G四鏈體或 Imotif 結(jié)構(gòu)在圓二色譜中有著特殊的峰結(jié)構(gòu)：平行型 G四鏈體在 265nm 附近有正的最大吸收峰，240nm 附近有負(fù)的最大吸收峰；反平行型的 G四鏈體在 295nm 附近有最大正吸收峰，260nm 有最大負(fù)吸收峰；混合式的 G四鏈體構(gòu)型則包括了 290nm 附近的正吸收以及特征的 265nm 附近的肩峰。外部堆積模式來(lái)有許多結(jié)構(gòu)特點(diǎn)來(lái)維持整個(gè)分子能量穩(wěn)定，末端G四分體更容易與配體形成共軛結(jié)構(gòu)，結(jié)合位點(diǎn)較易識(shí)別，動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定， 化合物的作用模式更傾向于外部堆積模式。G四螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定劑或 G四螺旋形成誘導(dǎo)劑的優(yōu)勢(shì)在于 G四螺旋結(jié)構(gòu)具有特異性，故具備更強(qiáng)的選擇性，從而大大降低了傳統(tǒng)化療藥物的毒性。正是由于這個(gè)閉合結(jié)構(gòu)，端粒顯現(xiàn)出了對(duì)于染色體的穩(wěn)定及其基因組的完整非常重要的作用，它為染色體末端提供保護(hù)性，防止染色體互相融合、重組及一些外切酶、連接酶的作用，防止DNA的損傷，并計(jì)數(shù)在線性DNA 復(fù)制時(shí)出現(xiàn)的末端DNA片斷的丟失。四鏈體四鏈體之間通過(guò)ππ作用相互堆積結(jié)合在一起。它是指DNA中單鏈與雙鏈、雙鏈之間的相互作用形成的三鏈或四鏈結(jié)構(gòu)，由DNA雙螺旋進(jìn)一步扭曲，包括線狀雙鏈中間可能有的扭結(jié)和超螺旋、多重螺旋及環(huán)狀DNA 中諸如超螺旋和連環(huán)之類的各種拓?fù)鋵W(xué)狀態(tài)。RNA 主要由含腺嘌呤(A) 、鳥(niǎo)嘌呤(G)、胞嘧啶 (C)和尿嘧啶(U) 的核苷酸構(gòu)成。生物體內(nèi)核酸常與蛋白質(zhì)結(jié)合形成核蛋白。 金屬鉑抗癌藥物的發(fā)展自1967年美國(guó)密執(zhí)安州立大學(xué)教授Rosenberg ，經(jīng)過(guò)30多年的發(fā)展，鉑類金屬抗癌藥物的合成應(yīng)用和研究得到了迅速的發(fā)展。與此同時(shí)，研究藥物和 DNA 的相互作用是藥物發(fā)現(xiàn)和藥品研發(fā)過(guò)程中最重要的課題之一。鉑系抗腫瘤藥物在臨床使用上具有毒副作用大以及耐藥性的問(wèn)題，促使研究者積極尋找非鉑系抗腫瘤藥物。第二代鉑類配合物（），其中以卡鉑為代表（），其水溶性優(yōu)于順鉑，腎毒性低于順鉑，主要不良反應(yīng)為骨髓抑制。核酸是生物體內(nèi)的高分子化合物。DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)分為兩大類：一類是右手螺旋，如ADNA、BDNA、CDNA 、DDNA等；另一類是左手雙螺旋，如ZDNA。由于富G DNA中的G 殘基都是成串排列的，因此，當(dāng)四條或四段富G單鏈DNA的G殘基并肩形成Hoogsteen堿基配對(duì)時(shí)，就形成了一個(gè)由4個(gè)G 殘基的雜環(huán)平面聯(lián)合形成的Gquartet 平面。端粒是真核細(xì)胞染色體末端的一種特殊的核蛋白復(fù)合體，由高度重復(fù)序列的端粒 DNA 和端粒結(jié)合蛋白組成 [17]。而在腫瘤細(xì)胞中，端粒酶的活性被激活，使得它可以維持端粒的長(zhǎng)度，從而維持腫瘤的繼續(xù)分裂、增殖和生長(zhǎng)，因此這個(gè)細(xì)胞不能進(jìn)入正常的老化和衰亡，從而獲得一種永生性。即小分子配體和 Gquadruplex 的末端 G四鏈體形成共軛結(jié)構(gòu)；2) 插入模式。 熒光光譜熒光光譜法是研究小分子與核酸相互作用的主要手段。共 32 頁(yè) 第 12 頁(yè)┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊裝┊┊┊┊┊訂┊┊┊┊┊線┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊ 流體力學(xué)方法應(yīng)用流體力學(xué)技術(shù)測(cè)試 DNA 雙螺旋長(zhǎng)度變化。3）5，6二氨基鄰菲羅啉共 32 頁(yè) 第 15 頁(yè)┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊裝┊┊┊┊┊訂┊┊┊┊┊線┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊NNNO2NH2N2H42OPd/CNNNH2NH2MolecularWeight:240. MolecularWeight:將 5硝基6 氨基鄰菲羅啉溶于 400mL 無(wú)水乙醇，加熱回流至全溶，再加 Pd/C 催化劑（10% Pd）攪拌混合均勻，并在 15min 之內(nèi)逐滴加入 4mL 水合肼（80% ） 。摩爾消光系數(shù)為105m3cm1，DNA 濃度 [DNA]=KA260/105（K 是稀釋倍數(shù)） ，單位是 mol?L1。但是由于兩個(gè)吸收峰所在波長(zhǎng)比較接近，因此在圖中只表現(xiàn)為一個(gè)寬的吸收帶。因此，推測(cè)配合物1是通過(guò)堆積到G四鏈體末端的四分體與 G四鏈體作用的，即以外部堆積模式結(jié)合的。因此可以通過(guò)觀察熒光強(qiáng)度的變化情況來(lái)識(shí)別特異性端粒結(jié)構(gòu)，圖中變化情況還顯示K +環(huán)境下G 四鏈體的加入對(duì)配合物1，2 的熒光強(qiáng)度影響大于 Na+環(huán)境下的熒光強(qiáng)度變化。（4）熒光大幅增強(qiáng)說(shuō)明配合物與G四鏈體的鍵合能力很強(qiáng)，由于 G四鏈體末端的四分體結(jié)構(gòu)便于平面芳香環(huán)堆積，所以可以通過(guò)觀察熒光強(qiáng)度的變化情況來(lái)識(shí)別特異性端粒結(jié)構(gòu)。共 32 頁(yè) 第 27 頁(yè)┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊裝┊┊┊┊┊訂┊┊┊┊┊線┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊0 2 4 6 8 100501015020IntesityConcetration/uM圖 414 配合物 1 滴定 DNA 鈉離子緩沖溶液在 600nm 左右的吸收峰滴定趨勢(shì)圖，[Ru]=10uM，600nm左右的吸收峰變化是由于配合物1 濃度的增加 (從0,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10μM)。G四鏈體被認(rèn)為對(duì)體內(nèi)端粒酶延長(zhǎng)端粒具有負(fù)向調(diào)控作用。共 32 頁(yè) 第 21 頁(yè)┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊裝┊┊┊┊┊訂┊┊┊┊┊線┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊30 40 5001absWavelngth/nm 合 5uL DNA 10 5uL A 20 DN 5uL A 30 5uL DNA 40 圖 44 鈉離子緩沖溶液配合物 2 與端粒 Gquadruplex 作用的紫外滴定曲線,[Ru]=10uM,450nm左右的吸收峰變化是由于DNA 濃度的增加 (從0,1,2,3,4,5,6,7,8μM)。在 200800nm 范圍內(nèi)檢測(cè)配合物的電子吸收光譜的變化。將其自然冷卻至室溫，避光放置過(guò)夜?，F(xiàn)列出實(shí)驗(yàn)步驟，以供參考、指正，預(yù)防此后的科研出現(xiàn)不必要的重復(fù)工作。又由于 CD 光譜法靈敏度高，樣品在很低的濃度下就可以檢測(cè)到特征吸收，圓二色譜成為一個(gè)很有效的檢測(cè)手段。吸收光譜是研究配合物與DNA 相互作用比較直接的一種方法。共 32 頁(yè) 第 9 頁(yè)┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊裝┊┊┊┊┊訂┊┊┊┊┊線┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊圖 G四鏈體與端粒、端粒酶和腫瘤的關(guān)系示意圖 本文所做的工作本文將合成一種順鉑配合物，用熒光光譜、紫外光譜觀察金屬配合物與DNA的G四鏈體的鍵合作用及性質(zhì)。端粒的長(zhǎng)短在細(xì)胞癌變和衰老中起著重要作用。G