【正文】 五、 等電結(jié)晶 等電點(diǎn)法是指用在電中性時(shí)L異亮氨酸的溶解度最低的原理進(jìn)行分離純化的這樣一個(gè)過(guò)程。該法具有操作方便、設(shè)備簡(jiǎn)單、三廢易于處理、投資少等特點(diǎn)，但提取收率很低。經(jīng)過(guò)粗結(jié)晶得到的晶體一般都會(huì)含有少量的雜質(zhì)。七、干燥 干燥就是用熱能加熱物料，讓其中的水分蒸發(fā)或用冷凍法使物料中的水分結(jié)冰升華而除去的操作。 這里采用離交等電點(diǎn)法提取L異亮氨酸。 第二節(jié) 各分離工藝一、 膜分離工藝流體相間的一薄層凝聚相物質(zhì)，它把流體相分隔成兩部分，我們將該薄層物質(zhì)稱為膜。膜可以將液體或氣體分開(kāi)。習(xí)慣上將膜原料一側(cè)稱為膜上游，而將透過(guò)側(cè)稱為膜下游。 （2）有將流體相隔開(kāi)的界面：它將透過(guò)液和保留液分為互不混合的兩相。（三）膜分離的特點(diǎn) （1）在常溫下進(jìn)行操作； （2）是物理過(guò)程，無(wú)需加入化學(xué)試劑； （3）無(wú)相變化（因而能耗較低）； （4）通常情況下選擇性都較高； （5）濃縮和純化可由一個(gè)步驟來(lái)完成； （6）設(shè)備易放大，可以分批操作，也可連續(xù)操作。 膜污染的處理有方法物理和化學(xué)兩種：物理方法：等壓沖洗、反沖洗、脈沖流動(dòng)、靜置浸泡加水力反沖洗、超聲波；化學(xué)方法及藥品：起溶解作用的物質(zhì)、起切斷離子結(jié)合作用的方法、起氧化作用的物質(zhì)、起滲透作用的物質(zhì) THE FILTRATION SPECTRUM 過(guò)濾譜圖（四）有機(jī)微濾膜除菌體蛋白 微孔膜是一種均勻而多孔的薄膜，通常厚度在90～150μm左右，～10um之間，～。通常能將液體中所有不小于制定孔徑的微粒全部截留下來(lái)； （2）孔隙大，則流速快。但是膜很薄，阻力也小，其過(guò)濾速度比其他常規(guī)的過(guò)濾介質(zhì)要快出幾十倍；（3）通常無(wú)吸附或少吸附。微孔膜一般都是均一的高分子材料制成的，過(guò)濾過(guò)程中沒(méi)有碎屑或纖維脫落，所以可以得到高純度的濾液。雖然升溫將有利于膜通量的提高，可是溫度一旦高達(dá)42℃，膜通量的增加將會(huì)變得很緩慢，因?yàn)檫^(guò)高的溫度使菌體發(fā)生了絮凝。考慮到有機(jī)膜的使用壽命和能耗等，這里確定的操作溫度為41℃左右。 參照《生物工業(yè)下游技術(shù)》和《生物分離原理與技術(shù)》我們了解到超濾膜的結(jié)構(gòu)主要分為下面這三層： （1）最上層的表面活性層：～，致密而光滑； （2）中間的過(guò)渡：厚度一般為1～10μm，具有大于10nm的細(xì)孔； （3）最下面的支撐層：厚度為50～250μm，出現(xiàn)50nm以上的孔。 根據(jù)相關(guān)資料，這里選擇35℃作為操作溫度。在這樣的操作條件下，L異亮氨酸的收率可達(dá)到93%以上，且色素去除率可達(dá)到94%以上。L異亮氨酸是一種兩性電解質(zhì)，且為中性氨基酸，等電點(diǎn)為pI=，在酸性溶液中，L異亮氨酸以陽(yáng)離子狀態(tài)存在，因而能被陽(yáng)離子交換樹(shù)脂交換吸附；在堿性溶液中，L異亮氨酸以陰離子狀態(tài)存在，因而能被陰離子交換樹(shù)脂交換吸附。而它與L異亮氨酸等電點(diǎn)接近，所以等電結(jié)晶時(shí)并不能很好的分離，這就需要離子交換法的單元操作對(duì)濾液進(jìn)行處理。參照《生物分離原理與技術(shù)》可知離子交換法有這樣一些的特點(diǎn)： （1）優(yōu)點(diǎn)：a、設(shè)備簡(jiǎn)單、成本低 b、提取周期短、效率高 c、工藝操作方便 d、不需使用大量有機(jī)溶劑 （2）缺點(diǎn)：a、輔助時(shí)間長(zhǎng)（洗脫、再生、活化、輔助時(shí)間約為提取時(shí)間的10倍以上） b、pH變化范圍大 c、消耗大量酸堿 d、對(duì)某些產(chǎn)品難于找到合適的樹(shù)脂（三）根據(jù)《生物工業(yè)下游技術(shù)》、《生物分離原理與技術(shù)》及生物分離原理課堂上老師的講解我們可以把離子交換過(guò)程包括為五個(gè)步驟： （1）L異亮氨酸（如圖A+）自溶液中擴(kuò)散到WA2樹(shù)脂表面，屬于外擴(kuò)散 （2）L異亮氨酸（如圖A+）從WA2樹(shù)脂表面再擴(kuò)散到樹(shù)脂內(nèi)部的活性中心，屬于內(nèi)擴(kuò)散 （3）L異亮氨酸（如圖A+）與樹(shù)脂中的B+在活性中心上發(fā)生離子交換，屬于交換反應(yīng) （4）解吸附離子B+自WA2樹(shù)脂內(nèi)部擴(kuò)散至樹(shù)脂表面，屬于內(nèi)擴(kuò)散 （5）B+離子再?gòu)腤A2樹(shù)脂表面擴(kuò)散到溶液中，屬于外擴(kuò)散， 且通常交換速度都比擴(kuò)散速度快很多，所以，離子交換反應(yīng)過(guò)程中的速度主要取決于擴(kuò)散速度，而非交換速度。L異亮氨酸發(fā)酵液流經(jīng)WA2陽(yáng)離子交換柱時(shí)，由于各個(gè)物質(zhì)與樹(shù)脂的親和力大小不一樣，參照《氨基酸工藝學(xué)》可以總結(jié)出，最終被交換吸附的物質(zhì)由柱頂?shù)街状笾驴煞譃榱鶄€(gè)層次：第一層次：K+、Na+、Mg2+、Ca+等金屬離子；第二層次：NH4+離子；第三層次：中堿性氨基酸；第四層次：L異亮氨酸；第五層次：酸性氨基酸；第六層次：有機(jī)色素。繼續(xù)進(jìn)行交換，則已交換到樹(shù)脂上的L異亮氨酸又被剛流入柱中的上柱液中含的金屬離子和銨離子置換下來(lái)，隨著上柱液不斷的向下流動(dòng)，它再次和下面一層還未交換過(guò)的樹(shù)脂發(fā)生交換，可是很快又被后加的上柱液中的金屬離子和銨離子置換下來(lái)。而L異亮氨酸離子的密度卻相反，是自上而下逐漸增加的。（四）離子交換反應(yīng)和離子交換過(guò)程：[16]上柱交換：RSO3H+ + NH3+CHR39。COOH RSO3H + NH4Cl → RSO3 NH4 + HCl洗脫：RSO3NH3 CHR39。COOH + H2O RSO3NH4 + NaOH → RSO3Na + NH4OH再生：RSO3Na + HCl → RSO3H + NaCl（五）樹(shù)脂的選擇：選擇合適的樹(shù)脂是離交的關(guān)鍵之一。根據(jù)《生物工業(yè)下游技術(shù)》、《生物分離原理與技術(shù)》及《氨基酸發(fā)酵工藝學(xué)》我們可以總結(jié)出，被用于氨基酸提取用的樹(shù)脂應(yīng)具備這樣一些基本條件： （1）具有在水、堿、酸條件下不可溶性； （2）具有機(jī)械強(qiáng)度高、耐磨性能好，反復(fù)使用而不易破碎； （3）好的耐熱性、穩(wěn)定化學(xué)性質(zhì)，溶液中的物質(zhì)不能將其破壞； （4）交聯(lián)度和膨脹度均要適中； （5）高的交換容量； （6）交換時(shí)具有快的平衡速度。另外樹(shù)脂的表面還會(huì)有灰塵等污物。 新樹(shù)脂裝柱后，用去離子水浸泡大約12h，使其充分吸水膨脹，然后用大概為樹(shù)脂體積的2~3倍的10%的鹽水浸泡4h以上。 這里用WA2陽(yáng)離子交換樹(shù)脂提取L異亮氨酸，樹(shù)脂先用適量的5％氨水處理浸泡4h左右，水洗至pH=8。 （2）上柱交換 上柱交換是離交的關(guān)鍵所在，最好能將所需要吸附的離子完全吸附，且要求比較集中。本設(shè)計(jì)采用順流進(jìn)行。pH值適宜范圍因樹(shù)脂的類型而變。B、上柱量的控制 ：一次性通過(guò)離交柱時(shí)達(dá)到的交換處理的最大容積量就是上柱量。上柱量最好能與樹(shù)脂的交換能力相符合。 交換量用單位體積濕樹(shù)脂或單位質(zhì)量干樹(shù)脂所吸附的1價(jià)離子的毫摩爾數(shù)表示。工作交換量是指工作狀態(tài)時(shí)的實(shí)際交換量。在下文的設(shè)計(jì)計(jì)算中有具體的論證。在下文的設(shè)計(jì)計(jì)算中有具體的論證。這樣做目的是除去柱中殘存殘?zhí)?、菌體等雜質(zhì)，另外還能達(dá)到松散和平整樹(shù)脂的作用，接著再用合適的熱水反沖。 ~ ，而反洗時(shí)WA2樹(shù)脂的膨脹度不應(yīng)小于50%。該法具有目的產(chǎn)物純度高，達(dá)到濃縮效果的優(yōu)點(diǎn)，適用于目的產(chǎn)物濃度低但工作液量大的溶液。 本設(shè)計(jì)采用氨水把L異亮氨酸從樹(shù)脂上洗脫下來(lái)。所以氨水不可能完全用于與L異亮氨酸的交換，這就是為什么氨水的實(shí)際用量比理論值多得多的原因。其缺點(diǎn)就是樹(shù)脂吸附的Ca2+ 、Mg2+ 等陽(yáng)離子不易洗脫，且它們的量會(huì)隨操作次數(shù)的不斷增加而積累，這樣一來(lái)就會(huì)導(dǎo)致樹(shù)脂吸附L異亮氨酸的能力降低。若是為了濃縮，則需要較高濃度的洗脫劑；若是為了分離，則只能用適當(dāng)濃度的洗脫劑。通常情況下，洗脫流速應(yīng)比上柱流速慢，以便L異亮氨酸的高峰相對(duì)較集中。用再生劑再生后，用清水洗至所需的PH值。 洗脫后的樹(shù)脂，絕大多數(shù)會(huì)變?yōu)镹a+型，而小部分則是NH4+型，這時(shí)就不能繼續(xù)吸附L異亮氨酸了，應(yīng)先將樹(shù)脂重新變?yōu)镠+型 。這里選用鹽酸進(jìn)行再生，其流入交換柱內(nèi)的速度不宜太快，通?？刂圃谏现魉俚?/2左右為宜，前期可略快，中后期就應(yīng)稍微減慢，從而達(dá)到用有限的鹽酸就可以使樹(shù)脂完全再生。再生劑用量在下文有相關(guān)的計(jì)算。保藏溫度不小于0℃，且要注意防止它接觸到氧化劑、油污和K+、Na+、Mg2+、Ca+ 等金屬離子，還要注意避光。但其選擇性較差，且采用不同生產(chǎn)原料和制備方法得到的活性炭其吸附力也不同。 而其脫色除雜主要是利用它表面的吸附作用，它的表面有無(wú)數(shù)微小的孔隙，所以表面積很大，具有非常強(qiáng)的吸附色素的作用。物理吸附的機(jī)理為：由吸附劑表面與被吸附物的分子之間的范德華力所引起。但是有較快的吸附過(guò)程，低溫時(shí)吸附量大，高溫時(shí)吸附量反而降低。而化學(xué)吸附的機(jī)理則是：由于吸附劑表面存在一些不飽和的價(jià)鍵，這些鍵可以和被吸附物分子的極性基團(tuán)形成相應(yīng)的副價(jià)鍵，進(jìn)而產(chǎn)生吸附作用；它的特點(diǎn)是有一定的選擇性，且適當(dāng)升溫能加快吸附速度，整個(gè)吸附過(guò)程還會(huì)發(fā)生能量的變化，解吸較物理吸附困難。粉末炭的顆粒非常細(xì)，為粉末狀，而吸附力、表面積、吸附量都特別大，屬于活性炭中吸附力最強(qiáng)的一類。顆粒炭的顆粒較粉末炭的大，它的總表面積也相應(yīng)減小，且吸附量和吸附力均較前者小，但過(guò)濾速度比粉末活性炭快。而顆粒脫色主要用于最后一次脫色?，F(xiàn)在我國(guó)氨基酸工業(yè)大體上都會(huì)采用活性炭進(jìn)行脫色的工藝。將經(jīng)過(guò)前處理的L異亮氨酸液注入顆?；钚蕴棵撋?，并控制ph、流量、溫度等條件，這樣得到的脫色柱流出液就是脫色液。 四、濃縮濃縮是工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程提取與精制中常用的單元操作之一，它的目的主要是通過(guò)除去溶劑而將低濃度的溶液轉(zhuǎn)變?yōu)楦邼舛鹊娜芤骸?（一）、 反滲透反滲透法較其他方法所具有的顯著優(yōu)點(diǎn)是：無(wú)需加熱、相態(tài)不變、效率高、操作方便、占地小、能量消耗少等。反滲透從結(jié)構(gòu)上分為：均質(zhì)膜、非對(duì)稱膜、動(dòng)態(tài)膜、復(fù)合膜；從材料上分為：芳香聚酰胺膜、醋酸纖維膜、無(wú)機(jī)質(zhì)膜、高分子電解質(zhì)膜等。根據(jù)《生物工業(yè)下游技術(shù)》一書我們了解到，它在生物工業(yè)中的主要應(yīng)用于這些方面： （1）生物堿、疫苗、激素、抗生素等的分離濃縮。 （3）白酒除濁和凈化。 反滲透技術(shù)所分離的產(chǎn)物的分子量一般都不大于500，而操作壓力為2～100MPa。反滲透膜用于分離處理液中分子量小于500的物質(zhì)；超濾膜用于分子量大于500的大分子，也可用于極細(xì)的膠體粒子的分離；～10μm的粒子。溫度、液面蒸汽分子密度、蒸發(fā)面積均會(huì)影響到蒸發(fā)速度，溫度升高，蒸發(fā)速度也會(huì)變快；液體的表面積越大，蒸發(fā)速度就越快；而液面蒸汽分子密度越小，則蒸發(fā)速度就越快。而由蒸發(fā)器和冷凝器這兩個(gè)部分組成相應(yīng)的蒸發(fā)系統(tǒng)。冷凝器也是一個(gè)換熱器，且它有間歇式和直接接觸式兩種類型，在冷凝器內(nèi)二次蒸汽被冷凝后排出系統(tǒng)。由于操作壓力的不同，可將蒸發(fā)過(guò)程分為減壓蒸發(fā)（真空蒸發(fā)）和常壓蒸發(fā)。而真空蒸發(fā)反之，不凝性氣體只能用真空泵抽出。 （2）溶液的沸點(diǎn)低，即使是同樣的加熱蒸汽，蒸發(fā)器傳熱的平均溫度差也大，所需的傳熱面積很小。 （4）蒸發(fā)器操作溫度較低，系統(tǒng)的熱損失小。 （6）因?yàn)槔淠骱驼舭l(fā)器的內(nèi)壓力低于大氣壓，導(dǎo)致了冷凝水和完成液都需要泵排出。這里我們采用降膜式真空蒸發(fā)設(shè)備進(jìn)行操作。因?yàn)椴煌陌被崞涞入婞c(diǎn)也不同，且在等電點(diǎn)時(shí)，L異亮氨酸分子的凈電荷為零，L異亮氨酸彼此吸引形成大分子進(jìn)而淀淀下來(lái)。 L異亮氨酸分子中有兩種不一樣的特殊基團(tuán)：親水基團(tuán) COOH 和NH4+ ，憎水基團(tuán) CH2CH2CH3。L異亮氨酸溶于水，通常會(huì)以離子的狀態(tài)存在，且它的解離方式主要取決于溶液的PH值。（一）、 結(jié)晶原理 結(jié)晶指的就是溶質(zhì)能自動(dòng)從飽和溶液中析出，而形成新相的這樣一個(gè)過(guò)程。而溶液使達(dá)到過(guò)飽和狀態(tài)是結(jié)晶的前提，且結(jié)晶的推動(dòng)力是過(guò)飽和率。所以，如果想要讓溶質(zhì)從溶液中結(jié)晶析出，首先應(yīng)該讓溶液處于過(guò)飽和狀態(tài)。含量很低時(shí)，常溫下很難讓L異亮氨酸達(dá)到飽和，即溶液的過(guò)飽和率很小時(shí)，生成結(jié)晶的速度會(huì)較慢，導(dǎo)致了生成的晶核或晶核數(shù)量很少。 （2）晶種與育晶 L異亮氨酸起晶有：自然起晶和加晶種起晶這兩種方法。所以，在結(jié)晶操作中，通常都會(huì)在結(jié)晶將要開(kāi)始前就先投入一定數(shù)量的晶粒作為晶種。 通常情況下，％來(lái)取。若肉眼能看到有晶核，這就表明已經(jīng)形成不少晶核了，ph=6就可作為第一步的pH終點(diǎn)值，進(jìn)行停酸育晶，要注意保證一定的養(yǎng)晶和育晶時(shí)間（約2小時(shí)）。 （3）加酸速度的影響 。尤其出現(xiàn)發(fā)酵不正?，F(xiàn)象時(shí)，一定要注意緩慢地加酸，以便控制pH慢慢降低，最終使L異亮氨酸的溶解度漸漸地下降，這樣晶核的形成也不致于太多。 （4）雜質(zhì)的影響 雜質(zhì)對(duì)晶體生長(zhǎng)速率的影響表現(xiàn)為：抑制生長(zhǎng)、改變晶習(xí)、促進(jìn)生長(zhǎng)。雜質(zhì)對(duì)晶體生長(zhǎng)速率的影響方式有以下幾方面：A、改變?nèi)芤航Y(jié)構(gòu)或平衡飽和濃度，進(jìn)而改變晶體與溶液在界面上液層的特性，最終達(dá)到影響溶質(zhì)長(zhǎng)入晶體。在晶體生長(zhǎng)過(guò)快時(shí)會(huì)產(chǎn)生晶體缺陷和位錯(cuò)，而晶格不同也會(huì)出現(xiàn)吸藏現(xiàn)象，使得雜質(zhì)的質(zhì)點(diǎn)陷入L異亮氨酸晶體中。 高殘?zhí)堑挠绊懀篖異亮氨酸的溶解度將會(huì)增加，而且殘?zhí)潜旧硪桩a(chǎn)生晶體。 （5）攪拌的影響 晶粒在吸收溶質(zhì)后，周圍溶液的濃度就會(huì)下降，可見(jiàn)，攪拌有利于晶粒和溶質(zhì)接觸，也有利于長(zhǎng)晶。但攪拌太過(guò)于激烈，溶質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)過(guò)快，也不利于長(zhǎng)晶，也會(huì)造成晶體之間的相互碰撞摩擦，這不僅有損晶形得不到大晶體，還易出現(xiàn)二次成核現(xiàn)象。由于L異亮氨酸的溶解度會(huì)隨著溫度的降低而變小。 六、 重結(jié)晶 根據(jù)《生物工業(yè)下游技術(shù)》和《生物分離原理與技術(shù)》我們可以總結(jié)出重結(jié)晶的操作過(guò)程有如下幾個(gè)步驟： （1）首先要選擇合適的溶劑； （2）將粗結(jié)晶得到的物質(zhì)加入到少量的熱溶劑中，并使晶體溶解； （3）冷卻后使其再次結(jié)晶； （4）然后分離母液； （5）最后洗滌； 選擇合適的