【正文】 息。編碼區(qū)基因產(chǎn)生病毒的結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白；根據(jù)其對(duì)病毒感染性復(fù)制的影響，又可分為必需基因和非必需基因。 44 ? 各種野生型病毒顆粒都具有一定的包裝容量，即對(duì)所包裝的病毒基因組的長(zhǎng)度有一定的限制。 基因重組技術(shù)的發(fā)展使病毒載體的產(chǎn)生成為可能。 45 ? 然而，這樣的重組病毒作為基因轉(zhuǎn)移載體有許多缺點(diǎn)。因此必須經(jīng)過(guò)改造使其成為復(fù)制缺陷性病毒并且刪除致癌基因后才能用于基因治療。因此，必須刪除更多的病毒基因以騰出位置插入較大的外源 DNA。 47 LTR gag pol env φ LTR 長(zhǎng)末端 重復(fù)序列 調(diào)節(jié)和 啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄 產(chǎn)生病毒 核心蛋白 產(chǎn)生 逆轉(zhuǎn)錄酶 產(chǎn)生病毒 外膜蛋白 包裝信號(hào) 以反轉(zhuǎn)錄病毒為例： ： DNA前病毒的結(jié)構(gòu)特征 48 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建 ? 常用的是莫洛尼小鼠白血病病毒 (MoMLV)構(gòu)建的各類逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 LTR gag pol env φ LTR 長(zhǎng)末端 重復(fù)序列 調(diào)節(jié)和 啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄 包裝信號(hào) 目的基因 標(biāo)記基因49 LTR gag pol env LTR Gag蛋白 PoL蛋白 Env蛋白 包裝細(xì)胞系 LTR LTR 靶細(xì)胞 目的基因 標(biāo)記基因 LTR φ LTR 目的基因 標(biāo)記基因 1 2 3 4 5 假病毒顆粒的產(chǎn)生并感染靶細(xì)胞 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 重組逆轉(zhuǎn)錄病毒 (核酸部分是 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 ) 輔病毒 50 1）物理方法 （ 1） 電穿孔法（ electroporotion） 將細(xì)胞置于高壓脈沖電場(chǎng)中，通過(guò)電壓使細(xì)胞產(chǎn)生可逆性的穿孔。 瞬間 細(xì)胞 細(xì)胞膜核膜通透性增加 高壓脈沖 DNA滲入細(xì)胞 （ 2）顯微注射法（ microinjection ） 利用顯微操作把目的基因直接注入靶細(xì)胞或細(xì)胞核 不需要進(jìn)行基因工程的繁瑣操作，直接將裸露基因 DNA注入動(dòng)物肌肉或某些器官組織內(nèi)。 心臟，可使其心臟壁內(nèi)毛細(xì)血管增加 30%～ 40%； ，能分泌糖尿病所缺少的胰島素； Ⅸ 基因，可產(chǎn)生血友病所需的凝血因子等等。 例：轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制備 重組基因 DNA 微注射 （體外） 小鼠受精卵 回植 假妊娠 仔 鼠 動(dòng)物模型：轉(zhuǎn)基因鼠 (每個(gè)鼠細(xì)胞中都含有外源基因，按孟德爾方式遺傳 ) clone sheep Dolly 體細(xì)胞 提取 核 重組細(xì)胞 回植 Dolly 卵細(xì)胞 去核 細(xì)胞 （ 3）微粒子轟擊法 ? 利用亞微粒的 鎢 和 金 能吸附 DNA，并將其包裹起來(lái)形成微粒，通過(guò)物理途徑獲得高速度，微粒瞬間既可進(jìn)入靶細(xì)胞，達(dá)到轉(zhuǎn)移目的基因的目的，而不損傷靶細(xì)胞。 2）化學(xué)法 磷酸鈣沉淀法： 目的基因與磷酸鈣等物質(zhì)混合，形成沉淀的 DNA微細(xì)顆粒，易通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并整合到受體細(xì)胞基因組中，在適當(dāng)條件下得以表達(dá)。 3 脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)使用方便、成本低廉。 人工脂質(zhì)體膜具有如下特點(diǎn)： 1. 與體細(xì)胞相容，無(wú)毒性和免疫原性 2. 可生物降解，不會(huì)在體內(nèi)堆積 3. 可制成球狀 (~50 ?m)，包容大小不同的生物活性分子 4. 可帶有不同的電荷 5. 具有不同的膜脂流動(dòng)性、穩(wěn)定性、及溫度敏感性，能適應(yīng)不同的生理要求 64 脂粒與細(xì)胞膜之間四種可能的相互作用形式 膜間傳遞 吸附 細(xì)胞吞噬 融合 （ 2） 受體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移技術(shù) 將 DNA與細(xì)胞或組織親和性的配體偶聯(lián) ，可使 DNA具有靶向性 。 多聚陽(yáng)離子與配體共價(jià)連接后 ， 又通過(guò)電荷相互作用與帶負(fù)電荷的 DNA結(jié)合 ， 將 DNA包圍 ，只留下配體暴露于表面 。 受體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移技術(shù)示意圖 載體 優(yōu)點(diǎn) 缺點(diǎn) 逆轉(zhuǎn)錄病素毒 基因組小并且簡(jiǎn)單 可穩(wěn)定整合于宿主基因組 生物學(xué)特性清楚 可高效轉(zhuǎn)入復(fù)制中的細(xì)胞 對(duì)宿主細(xì)胞無(wú)害 僅感染分裂細(xì)胞 隨機(jī)整合（可能導(dǎo)致突變） 病毒滴度低（ 107pfu/ml） 可能會(huì)與有復(fù)制能務(wù)的病毒重組插入容量有限（ =8kb） 腺相關(guān)病毒 基因組?。?5kb） 可特異整合于人 19號(hào)染色體 以人細(xì)胞作為宿主 無(wú)毒、無(wú)致病性 尚未研究清楚 需腺病毒輔助復(fù)制 攜帶外源基因能力有限（ 4kb） 難得到高滴度病毒 腺病毒 適于原位使用，尤其是肺 (在不分裂細(xì)胞中可進(jìn)行高效率的體內(nèi)感染 病毒滴度高（ 1010pfu/ml） 生物學(xué)特性清楚 不與宿主基因組整合 (只有短暫表達(dá) ) 載本基因組復(fù)雜 病毒蛋白可能引起免疫及炎癥反應(yīng) 插入外源基因能力有限（ 78kb） 脂質(zhì)體 無(wú)感染能力 理論上無(wú) DNA大小限制 毒性低 無(wú)特異性靶細(xì)胞 轉(zhuǎn)染效率低 僅有短暫表達(dá) 體內(nèi)應(yīng)用困難 受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn) 無(wú)感染能力 特異性轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞 理論上無(wú) DNA大小限制 構(gòu)建靈活 轉(zhuǎn)染效率低 體內(nèi)應(yīng)用困難 可能有免疫原性 只有短暫表達(dá) (三 )、基因治療的途徑 ? 根據(jù)基因轉(zhuǎn)移的途徑分類： ex vivo(回體轉(zhuǎn)移或稱二步法） 將人體細(xì)胞從體內(nèi)取出 , 基因改造 , 再移植到人體中 。 有如普通治療藥物 , 商業(yè)化發(fā)展方向所在 。取出一小