分子克隆工具酶(2)-在線瀏覽
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【正文】 稱為 PIprefix）。 2022/6/23 西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè) 基因工程 14 四、 DNA末端長度對限制酶切割效率的影響 限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別和切割靶序列時(shí)需要識(shí)別序列兩側(cè)具有一定長度的 DNA，否則會(huì)降低切割效率。 對側(cè)翼長度敏感性高的酶有 AccⅠ 、 HindⅢ 、 PstⅠ 等，側(cè)翼 3個(gè)堿基以上也未必理想。 限制酶的活性單位（ unit）： 1個(gè)單位的酶是指在建議的緩沖液及溫度下，在 20μl反應(yīng)液中反應(yīng) 1h，使 1μg DNA（多用λ ）完全消化所需要的酶的量。 某些噬菌體 DNA中的某些相同的酶切位點(diǎn)對酶的敏感性不同。 EcoRⅠ 酶切割 λ 噬菌體中的 5個(gè)位點(diǎn)時(shí)并不是隨機(jī)的，靠近右端的位點(diǎn)比分子中間的位點(diǎn)切割快 10倍； EcoRⅠ 對腺病毒 2DNA不同位置切點(diǎn)的切割速率也不同。 原因：切割時(shí)需要同時(shí)與 2個(gè)識(shí)別位點(diǎn)作用（如 NarⅠ 等），或識(shí)別和切割時(shí)要求在 DNA上有 2個(gè)明顯不同的結(jié)合位點(diǎn)，其中1個(gè)是另 1個(gè)的被切割時(shí)起激活作用的變構(gòu)位點(diǎn)。 六、限制酶的酶切反應(yīng)條件 緩沖液（多數(shù)商家提供 10 貯藏液 ） ◆多數(shù) II型限酶需要相似的緩沖液，但鹽離子強(qiáng)度差異明顯： TrisHCl 50 mmol/L MgCl2 10 mmol/L NaCl 0100 mmol/L（ 0、 50、 100分別為低、中、高） DTT 1 mmol/L 一些限制酶還需要 添加 BSA（牛血清白蛋白）。 2022/6/23 西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè) 基因工程 17 體積和溫度 ：反應(yīng)體系一般用 20100 μL，視情況可大可小。 反應(yīng)時(shí)間 ：較純的 DNA（如試劑盒提?。┰跇?biāo)準(zhǔn)酶用量下反應(yīng) 14 h后可以達(dá)到完全，低的 DNA純度會(huì)降低酶切效率，增加酶的用量可縮短酶時(shí)間（但會(huì)增加星活力風(fēng)險(xiǎn)），延長反應(yīng)時(shí)間可以減少酶的用量，進(jìn)行部分酶切時(shí)要大大縮短反應(yīng)時(shí)間并減少酶的用量，真核生物尤其是植物基因組總DNA完全消化（如 Southern）時(shí)一般要消化 24 h左右。 七 、 限制酶的星活性 (star activity) ? 在極端非標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下 ， 限制性核酸內(nèi)切酶能切割與特異識(shí)別序列不同但相似的序列 ， 降低酶切反應(yīng)的特異性 ， 這種改變的特殊性稱為限制性核酸內(nèi)切酶的 星活性 。 ② 酶用量過大 ， 大于 100 U/μg DNA。 ④ 高 pH， 大于 。 ⑥ Mn2+、 Cu2+、 Co2+、 Zn2+等非 Mg2+的二價(jià)離子的存在 。 ? 辦法：對因改進(jìn)。 ? 部分限制酶除切割雙鏈 DNA外 ， 還可切割單 DNA， 但活性一般都不高 。 九 、 酶切位點(diǎn)的引入 現(xiàn)代基因工程中通過引物化學(xué)合成等方式可以很方便進(jìn)向目標(biāo)位置引入設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn) 。 十、影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素 ① DNA樣品的純度 DNA樣中混有蛋白質(zhì)、苯酚、氯仿、乙醇、 EDTA、SDS、 NaCl等都有可能抑制酶活性。 ? 大腸桿菌中的 dcm甲基化酶在 5′CCAGG3′或 5′CCTGG3′序列中的胞嘧啶 C5位上引入甲基，受其影響的酶有 EcoRII等，但 BglI、KpnI不受影響。 2022/6/23 西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè) 基因工程 22 十一、基因組中酶切位點(diǎn)分布的不均一性 在基因組中酶切位點(diǎn)的分布并不是均一的。 酵母中重復(fù)序列以外富含 GC的識(shí)別序列較少。 果蠅和線蟲中 CG基序雖然少，但不發(fā)生甲基化。 ② 整個(gè)操作應(yīng)在 0℃ 進(jìn)行 ， 即在冰浴中進(jìn)行 ， 而且是在加入其它試劑之后 ， 最后加入酶 。 ④ 當(dāng) DNA需 2種或以上酶切時(shí)，應(yīng)用通用緩沖液，若沒有通用緩沖液時(shí)，只有用 1種酶切完后，純化酶切產(chǎn)物，再進(jìn)行下一個(gè)酶切反應(yīng) 。 2022/6/23 西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè) 基因工程 24 Ⅱ 限制性核酸內(nèi)切酶的主要用途 ① 在特異位點(diǎn)上切割 DNA， 產(chǎn)生特異的限制性酶片段 。 ③ 構(gòu)建基因文庫 。 ⑤ 改建質(zhì)粒。 Dam甲基化酶 可在 GATC序列中的腺嘌呤的 N6位置上引入甲基。 一些酶對 Dam甲基化敏感 ，如 BclⅠ 、 ClaⅠ 、 XbaⅠ 等。 Dcm甲基化酶 識(shí)別 CCAGG或 CCTGG序列，在第二個(gè)胞嘧啶 C的 C5位置引入甲基。 一些酶 對 Dcm甲基化不敏感 ，如 BanⅠ 、 BglⅠ 、 KpnⅠ 等。 SssⅠ 甲基化酶 來自螺旋體，可使 CG序列中的 C在 C5位置上發(fā)生甲基化 敏感的酶有： ClaⅠ 、 XhoⅠ 、 SalⅠ 等。 2022/6/23 西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè) 基因工程 27 三、甲基化對限制酶切的影響 修飾酶切位點(diǎn) ：敏感的酶不能切開。 對基因組作圖的影響 ：哺乳動(dòng)物具有較多的 m5CG序列具有組織細(xì)胞特異性，而且一個(gè)細(xì)胞內(nèi)的 m5CG甲基化不徹底，所以用 m5CG甲基化敏感的限制酶作圖時(shí)具有可變性，對圖的穩(wěn)定性帶來影響。 第三節(jié) DNA聚合酶 DN
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