綠色熒光蛋白ppt課件-在線瀏覽
2025-06-29 03:02本頁面
【正文】 e marked with red atoms for oxygen and blue for nitrogen. 綠色熒光蛋白的結(jié)構(gòu)解析 綠色熒光蛋白的發(fā)光特性 GFP吸收的光譜 ,最大峰值為 395nm(紫外 ),并有一個峰值為 470nm的副峰 (藍光 )。 綠色熒光蛋白的發(fā)光特性 ? GFP的光譜特性與熒光素異硫氰酸鹽 (FITC)很相似，因此為熒光素 FITC設(shè)計的熒光顯微鏡濾光片組合也適用 GFP觀察。 ? GFP熒光極其穩(wěn)定，在激發(fā)光照射下， GFP抗光漂白(Photobleaching)能力比熒光素 (fluorescein)強，特別在 450～490nm藍光波長下更穩(wěn)定。而一些弱還原劑并不影響 GFP熒光。 但 GFP對某些封片指甲油特別敏感。 綠色熒光蛋白的發(fā)光特性 GFP發(fā)色團的骨架在左邊。這種保護對于發(fā)射熒光是必需的。但是在蛋白質(zhì)內(nèi)部改為發(fā)射能量稍低的光子來釋放能量，使它得到了保護。 綠色熒光蛋白的發(fā)光基團 GFP 熒光的產(chǎn)生主要歸功于分子內(nèi)第 6 66 、 67 位絲氨酸、酪氨酸、甘氨酸形成生色團的功效。這樣 , GFP 分子中形成對羥基苯甲酸咪唑環(huán)酮生色團 , 該過程可以自動催化完成。 resolution. The clear definition throughout the map allowed the chain to be traced and side chains to be well placed. The density for Ser65, Tyr66 and Gly67 is quite consistent with the dehydrotyrosine imidazolidone structure proposed for the fluorophore. Many of the side chains adjacent to the fluorophore are labeled. 綠色熒光蛋白的發(fā)光基團 目前對 GFP的熒光發(fā)光機制還不清楚， Morise等人曾提出一個能量傳遞模式圖來解釋水母的發(fā)光機制，但并未獲得認同。基態(tài) A對應(yīng)于 395nm的吸收峰，基態(tài) B對應(yīng)于 475nm的吸收峰，基態(tài) A占優(yōu)勢，基態(tài) B的分子數(shù)量約是基態(tài) A的 1/6，兩種基態(tài)間能緩慢地轉(zhuǎn)換，但激發(fā)態(tài) (*)之間的轉(zhuǎn)換很快且發(fā)生了質(zhì)子轉(zhuǎn)移， A*快速高效地衰變至另一激發(fā)態(tài)，應(yīng)該存在一個中間過度態(tài) I，質(zhì)子轉(zhuǎn)移使 A*轉(zhuǎn)變成 I*, I*回遷到基態(tài) I時產(chǎn)生發(fā)射峰 504nm的熒光，構(gòu)象改變使 I*轉(zhuǎn)變成 B*，由 B*到 B發(fā)射熒光而不發(fā)生質(zhì)子轉(zhuǎn)移。 綠色熒光蛋白的發(fā)光機制 475nm 504nm 綠色熒光蛋白的發(fā)光機制 ? 在離體狀態(tài)下 GFP對高溫 (70OC)、堿性、除垢劑、鹽、有機溶劑和大多數(shù)普通酶 (鏈霉蛋白酶除外 )有較強抗性 ? GFP融合蛋白的熒光靈敏度遠比熒光素標(biāo)記的熒光抗體高，抗光漂白能力強，因此更適用于定量測定與分析。 ? 由于 GFP熒光是生物細胞的自主功能，熒光的產(chǎn)生不需要任何外源反應(yīng)底物，因此 GFP作為一種廣泛應(yīng)用的活體報告蛋白 ,其作用是任何其它酶類報告蛋白無法比擬的。 人工 GFP Guohong Zhang等（ 1996）將 GFP的熒光強度提高了 35倍，轉(zhuǎn)染 16h~24h后仍可穩(wěn)定地測定熒光。 S65TGFP，激發(fā)譜 中只有一個峰，且紅移至 490nm，用藍光即可激發(fā) RSFP，使之更適于普通熒光顯微鏡觀察。這種藍光能進一步激發(fā) GFP產(chǎn)生綠光，即發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象（ FRET） 。 Crystal structure of a Cubound green fluorescent protein Zn biosensor Crystal structure of a Znbound green fluorescent protein biosensor 鋅離子 GFP傳感器 88mM FIPCBSM and 88 mM CaM (panels A–C) 88mM FIPCBSM alone (panels D–F). 鈣 離 子 GFP 傳 感 器 pH titrations of GFPs. (A) Fluorescence and absorbance of GFPS65T as a function of pH. Data were fitted to Eq. 1 with pKa and nH parameters given in the text. For parison, fluorescence titration for fluorescein is shown ( ). (B) Fluorescence of GFPF64L/S65T, GFPY66H, and GFPT203I as a function of pH with curve fits as in A. pHGFP傳感器 GFP在生物研究中的應(yīng)用 GFP在動物學(xué)研究中的應(yīng)用 ? GFP作為新型報告基因用于轉(zhuǎn)基因研究 作為報告基因構(gòu)建基因工程載體。 ? GFP融合蛋白用于研究蛋白質(zhì)定位、移動及相互作用 Hale GFP標(biāo)記，研究了可溶性微管蛋白 FtsZ與其內(nèi)膜受體 ZipA間的相互作用，發(fā)現(xiàn)， ZipAGFP融合蛋白在細胞壁溢縮前和溢縮過程中均位于 FtsZ與膜相關(guān)的特殊環(huán)中 。岳莉莉等成功地實現(xiàn)了 gfp與 HBVe抗原基因融合后在大腸桿菌和昆蟲細胞中高效表達，得到既能發(fā)射熒光又具有抗原性的雙功能融合蛋白，為獲得一種新型發(fā)光免疫診斷試劑
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