sdspage凝膠電泳(1)-在線瀏覽
2025-06-24 18:13本頁(yè)面
【正文】 電顆粒在電場(chǎng)作用下，主要靠 電荷和分子篩效應(yīng) 。 濃縮膠 ? 濃縮膠的作用是有堆積作用，凝膠濃度較小，孔徑較大，把較稀的樣品加在濃縮膠上，經(jīng)過(guò)大孔徑凝膠的遷移作用而被濃縮至一個(gè)狹窄的區(qū)帶。電泳開始后， HCl解離成氯離子，甘氨酸解離出少量的甘氨酸根離子。 濃縮膠 ? 電泳開始時(shí) 氯離子 泳動(dòng)率最大，超過(guò)蛋白，因此在后面形成低電導(dǎo)區(qū)，而電場(chǎng)強(qiáng)度與低電導(dǎo)區(qū)成反比，因而產(chǎn)生較高的電場(chǎng)強(qiáng)度，使蛋白和甘氨酸根離子迅速移動(dòng)，形成以穩(wěn)定的界面，使 蛋白聚集 在移動(dòng)界面附近，濃縮成一中間層。上層為濃縮膠，下層為分離膠。在濃縮膠中 HCl幾乎全部解離為 Cl，但只有極少部分甘氨酸解離為 H2NCH2COO。當(dāng)電泳系統(tǒng)通電后，這 3種離子同向陽(yáng)極移動(dòng)。 濃縮效應(yīng)之一 濃縮效應(yīng)之二 電泳開始后，快離子在前，在它后面形成離子濃度低的區(qū)域即低電導(dǎo)區(qū)。這種高電壓梯度使蛋白質(zhì)和慢離子在快離子后面加速移動(dòng)。由于蛋白質(zhì)的有效移動(dòng)率恰好介于快慢離子之間，因此蛋白質(zhì)離子就集聚在快慢離子之間被濃縮成一條狹窄帶。 樣品進(jìn)入分離膠后，慢離子甘氨酸全部解離為負(fù)離子，泳動(dòng)速率加快，很快超過(guò)蛋白質(zhì)，高電壓梯度隨即消失。 電荷效應(yīng)之一 電荷效應(yīng)之二 與 SDS結(jié)合的蛋白質(zhì)的構(gòu)型也發(fā)生變化，在水溶液中 SDS蛋白質(zhì)復(fù)合物都具有相似的形狀，使得 SDSPAGE電泳的泳動(dòng)率不再受蛋白質(zhì)原有電荷與形狀的影響。 電荷效應(yīng)之三 但在 SDSPAGE電泳中，由于 SDS這種陰離子表面活性劑以一定比例和蛋白質(zhì)結(jié)合成復(fù)合物，使蛋白質(zhì)分子帶負(fù)電荷，這種負(fù)電荷遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了蛋白質(zhì)分子原有的電荷差別，從而降低或消除了蛋白質(zhì)天然電荷的差別；此外，由多亞基組成的蛋白質(zhì)和 SDS結(jié)合后都解離成亞單位，這是因?yàn)?SDS破壞了蛋白質(zhì)氫鍵、疏水鍵等非共價(jià)鍵。 在沒(méi)有交聯(lián)劑的情況下聚合的丙烯酰胺形成毫無(wú)價(jià)值的粘稠溶液 ， 而經(jīng)雙丙烯酰胺交聯(lián)后凝膠的剛性和抗張強(qiáng)度都有所增加 ，并形成 SDS蛋白質(zhì)復(fù)合物必須通過(guò)的小孔 。 SDS聚丙烯酰胺凝膠大多按 “ 雙丙烯酰胺～丙烯酰胺 ” 為 1： 29 配制 ， 試驗(yàn)表明它能分離大小相差只有 3% 的蛋白質(zhì) 。 用 5～ 15%的丙烯酰胺所灌制凝膠的線性分離范圍如下表： 丙烯酰胺濃度（ %） 線性分離范圍（ kD） 15 12～ 43 10 16～ 68 36～ 94 57～ 212
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