sds聚丙烯酰胺凝膠電泳(1)-在線瀏覽
2025-07-13 13:12本頁面
【正文】 鑒定 。 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（ PAGE） 測定蛋白質(zhì)分子量 一 . 實驗?zāi)康? ?學(xué)習(xí) SDSPAGE測定蛋白質(zhì)分子量的原理 。 ?掌握垂直板電泳的操作方法 。 二 .實驗原理 ? 帶電質(zhì)點在電場中向帶有異相電荷的電極移動 ， 這種現(xiàn)象稱為電泳 。 ? 區(qū)帶電泳是在半固相或膠狀介質(zhì)上加一個點或一薄層樣品溶液 ， 然后加電場 ， 分子在支持介質(zhì)上或 支持介質(zhì)中遷移 。 ? 區(qū)帶電泳使用不同的支持介質(zhì) ， 早期有濾紙 、 玻璃珠 、淀粉粒 、 纖維素粉 、 海砂 、 海綿 、 聚氯乙烯樹脂；以后有淀粉凝膠 、 瓊脂凝膠 、 醋酸纖維素膜 ， 現(xiàn)在則多用聚丙烯酰胺 （ PAGE） 和瓊脂糖凝膠 。不連續(xù)系統(tǒng)中由于緩沖液離子成分 ， pH，凝膠濃度及 電位梯度的不連續(xù)性 ， 帶電顆粒在電場中泳動不僅有電荷效應(yīng) ， 分子篩效應(yīng) ， 還具有濃縮效應(yīng) ， 因而其分離條帶清晰度及分辨率均較前者佳 。 當(dāng)分子量在 15KD到 200KD之間時 ，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系 ， 符合下式：logMW=KbX， 式中： MW為分子量 ， X為遷移率 ， k、 b均為常數(shù) ， 若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對分子量對數(shù)作圖 ， 可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線 ， 未知蛋白質(zhì)在相同條件下進行電泳 ， 根據(jù)它的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量 。影響它們結(jié)合的因素主要有三個： 1) 溶液中 SDS單體的濃度，當(dāng)單體濃度大于1mmol/L時大多數(shù)蛋白質(zhì)與 SDS結(jié)合的重量比為 1:，如果單休濃度降到 mmol/L以下時，兩者的結(jié)合比僅為 1: 白質(zhì)原有的電荷差別，為保證蛋白質(zhì)與 SDS的充分結(jié)合，它們的重量比應(yīng)該為 1:4或 1:3 2) 樣品緩沖液的離子強度。 因此在用SDS處理樣品同時往往用巰基乙醇處理 ， 巰基乙醇是一種強還原劑 ， 它使被還原的二硫鍵不易再氧化 ， 從而使很多不溶性蛋白質(zhì)溶解而與 SDS定量結(jié)合 。 ? 已發(fā)現(xiàn)有些蛋白質(zhì)不能用 SDSPAGE測定分子量 。 ? 一般至少采用兩種方法測定未知樣品的分子量 ， 互相驗證 。 (1)
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