【正文】 體的形貌和結(jié)構(gòu)等。主要分為透射電子顯微電鏡、掃描電子顯微電鏡、分析電子顯微鏡和高壓電子顯微鏡。透射電鏡主要用于觀察組織細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。鏡體系統(tǒng)是電鏡的主體，結(jié)構(gòu)相當(dāng)復(fù)雜，又分為照明系統(tǒng)、成像系統(tǒng)和觀察記錄系統(tǒng)。在電鏡中電子射線在幾萬伏的加速電壓作用下產(chǎn)生了短波長高能電子束，加速電壓越高，電子束的波長越短，電鏡的分辨率就越高。成像系統(tǒng)由樣品室、物鏡、中間鏡和投影鏡組成，是電鏡具有高放大倍率和高分辨率的關(guān)鍵部位，主要是借助改變各個(gè)透鏡的電流來獲得不同的放大倍率。觀察記錄系統(tǒng)包括觀察室和底片室。圖像的保留可通過熒光屏下的底片室內(nèi)的膠片感光，使圖像拍攝下來，也可將圖片通過探頭輸送到計(jì)算機(jī)中經(jīng)打印機(jī)打出圖片。 掃描電子顯微鏡 掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope）簡(jiǎn)稱掃描電鏡。掃描電鏡的光源部分與透射電鏡相同，是由電子槍產(chǎn)生電子射線經(jīng)聚光鏡聚焦形成一束極細(xì)的光斑稱為電子探針（electron probe）。二次電子發(fā)射越多的地方，在像上相應(yīng)的點(diǎn)就越亮，反之則暗。 分析電子顯微鏡 分析電子顯微鏡（analytic electron microscope）簡(jiǎn)稱分析電鏡，是一種帶有特殊附件波譜儀（length disapersive spectroscope）或能譜儀（energy disapersive spectroscope）的電子顯微鏡。當(dāng)高速運(yùn)動(dòng)的電子會(huì)聚成電子束（探針）打到樣品上時(shí)，所激發(fā)出來的X射線波長是和樣品內(nèi)所含元素的原子序數(shù)密切相關(guān)的。利用分析電鏡可以在觀察樣品形貌的同時(shí)了解微小區(qū)域（如某一細(xì)微結(jié)構(gòu)）內(nèi)所含元素的種類及其含量，在細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)水平上對(duì)其內(nèi)部的化學(xué)元素成分進(jìn)行定位、定性、定量分析。 高壓電子顯微鏡 高壓電子顯微鏡（high voltage electron microscope）指加速電壓在120KV以上的透射電子顯微鏡，若加束電壓在500KV以上稱為超高壓電鏡。高壓電子顯微鏡的主要特點(diǎn)是分辨本領(lǐng)高，對(duì)樣品的穿透能力強(qiáng)，可用于觀察較厚的樣品，整體培養(yǎng)的細(xì)胞不需超薄切片即可觀察內(nèi)部的三維微細(xì)結(jié)構(gòu)，如微絲、微管等，在偏振鏡下可呈現(xiàn)三維排列的圖象特點(diǎn)。 （二）電鏡樣品制備技術(shù)電鏡樣品制備技術(shù)較復(fù)雜，種類也較多，分為普通樣品制備技術(shù)和特殊樣品制備技術(shù)。 超薄切片技術(shù) 超薄切片技術(shù)（ultramicrotomy）是透射電鏡樣品制備方法中最基本的一種。m，而透射電鏡切片厚度則要求在50～80nm左右。超薄切片技術(shù)包括：取材、固定、脫水、浸透、包埋、切片及染色。 負(fù)染色技術(shù) 負(fù)染色技術(shù)（nagtive stain technique）又稱陰性染色，是透射電鏡樣品制備技術(shù)中的一種。常用的重金屬有磷鎢酸鈉、醋酸鈾等。負(fù)染色樣品不需經(jīng)過固定、脫水包埋和超薄切片等復(fù)雜操作，而是直接對(duì)沉降的樣品勻漿懸浮液進(jìn)行染色。冷凍蝕刻技術(shù)能保持細(xì)胞原來的結(jié)構(gòu)，立體感鮮明，主要用于生物膜的研究。樣品制備采用戊二醛和鋨酸雙重固定；乙醇或丙酮脫水。由于生物樣品柔軟多水，大多數(shù)的組織含水量在80%以上，采用自然干燥，會(huì)受表面張力影響使細(xì)胞表面收縮，形態(tài)改變。由于干燥樣品不導(dǎo)電，因而需要在樣品表面鍍一層薄薄的金屬膜使樣品導(dǎo)電并增加圖像的反差和立體感。掃描探針顯微鏡有很多種，主要包括掃描隧道顯微鏡（scanning tunneling microscope, STM）和原子力顯微鏡（atomic force microscope, AFM）等。STM的主要原理是利用量子力學(xué)中的隧道貫穿效應(yīng)，其核心部件是一個(gè)能在樣品表面進(jìn)行掃描、與樣品之間保持一定偏壓、其直徑為原子尺度的探針（圖24）。當(dāng)針尖與樣品非?？拷鼤r(shí)，其間的勢(shì)疊變得很薄，電子云相互重迭，在針尖與樣品之間施加一電壓，電子就可以通過隧道效應(yīng)由針尖轉(zhuǎn)移到樣品或從樣品轉(zhuǎn)移到針尖，形成隧道電流。STM要求樣品表面與針尖具有導(dǎo)電性。在恒流模式中，STM通過反饋系統(tǒng)不斷調(diào)節(jié)針尖與樣品表面每個(gè)檢測(cè)點(diǎn)上的距離，使隧道電流保持一個(gè)不變的恒值，測(cè)定掃描頭上針尖與樣品表面的高度變化就可獲得樣品表面形貌等微觀信息。在恒高模式中，掃描頭不需要上下移動(dòng)，從而加快了掃描速度。AFM的工作原理是將一個(gè)對(duì)微弱力非常敏感的微懸臂一端固定，另一端裝上探針，針尖與樣品表面輕輕接觸，針尖尖端原子與樣品表面原子間極微弱的排斥力使微懸臂向上彎曲（圖25）。微懸臂的彎曲是多種力的共同作用結(jié)果，其中最普遍的是范得瓦爾力，針尖與樣品表面微小的距離變化就能產(chǎn)生不同大小的范得瓦爾力。 圖25 AFM工作原理圖 AFM也有兩種工作模式：恒力模式和恒高模式。在恒高模式中，掃描頭高度固定不變，從微懸臂在空間的偏轉(zhuǎn)信息中直接獲取樣品表面信息。SPM最早應(yīng)用于研究生物大分子（DNA和蛋白質(zhì)等）的結(jié)構(gòu)與功能，這方面已積累了豐富的資料。第二節(jié) 細(xì)胞化學(xué)技術(shù) 細(xì)胞化學(xué)技術(shù)（cytochemistry）是在保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整的條件下，通過細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)研究細(xì)胞內(nèi)各種成分(主要是生物大分子)的分布情況以及這些成分在細(xì)胞活動(dòng)過程中的動(dòng)態(tài)變化的技術(shù)，可以通俗地說，這類技術(shù)讓人們?cè)陲@微鏡下看到細(xì)胞內(nèi)大分子的位置。一、 酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)（enzyme cytochemistry）是通過酶的特異細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)來顯示酶在細(xì)胞內(nèi)的分布及酶活性強(qiáng)弱的一種技術(shù)。酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)對(duì)研究細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)與功能、細(xì)胞的生理與病理過程以及細(xì)胞器的相互關(guān)系曾發(fā)揮重要作用。因此有必要了解酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)。酶細(xì)胞化學(xué)的原理是：在一定條件下，使組織細(xì)胞內(nèi)的酶與其底物相互作用，形成初級(jí)反應(yīng)產(chǎn)物，再用捕捉劑在酶的作用部位進(jìn)行捕捉，使其在顯微鏡下可見。前面的酶反應(yīng)相當(dāng)于細(xì)胞內(nèi)自然條件下發(fā)生的酶促反應(yīng)，后面的捕捉反應(yīng)則是為了使酶反應(yīng)可見而人為造成的。捕捉反應(yīng)主要有金屬鹽沉淀法、色素形成和嗜鋨物質(zhì)生成法。在色素形成和嗜鋨物質(zhì)生成法中，捕捉底物在酶作用下轉(zhuǎn)化成色素沉淀于酶作用部位，在光鏡下可見；或者捕捉底物轉(zhuǎn)化成嗜鋨物質(zhì)，經(jīng)鋨酸作用后形成高電子密度的鋨黑，在電鏡下可見?，F(xiàn)以水解酶為例介紹如下： 初級(jí)反應(yīng)： 底物被磷酸水解酶作用后分解產(chǎn)生磷酸 磷酸水解酶 底物 → H3PO4 最終反應(yīng)： 磷酸與金屬捕捉劑結(jié)合形成反應(yīng)產(chǎn)物磷酸鉛（黑色、高電子密度） 捕捉劑（Pb2+） H3PO4 → Pb(PO4)2 （二）實(shí)驗(yàn)方法樣品制備 酶細(xì)胞化學(xué)的一個(gè)重要問題是既要保存好細(xì)胞內(nèi)酶的活性，又要保存好細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，因此選擇適當(dāng)?shù)墓潭▌┓N類、濃度、固定的方式和時(shí)間是細(xì)胞化學(xué)技術(shù)的一個(gè)關(guān)鍵問題。冷凍切片能較大限度地保存酶的活性，因此是光、電鏡酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)中常用的方法。孵育的溫度和時(shí)間可根據(jù)不同的酶和組織通過實(shí)驗(yàn)而確定?；緦?shí)驗(yàn)過程 光鏡樣品： 固定（酶固定＋結(jié)構(gòu)固定）→ 冷凍切片 → 細(xì)胞化學(xué)反應(yīng) （酶反應(yīng)＋捕捉反應(yīng)）→ 光鏡觀察 電鏡樣品： 固定（酶固定＋結(jié)構(gòu)固定）→切組織片→細(xì)胞化學(xué)反應(yīng) （酶反應(yīng)＋捕捉反應(yīng)）→脫水包埋→ 超薄切片→電鏡觀察二、 免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)（immunocytochemistry）是根據(jù)免疫學(xué)原理，利用抗原抗體特異結(jié)合的特性定位組織和細(xì)胞中特異大分子的一類技術(shù)。應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)可在原位檢測(cè)細(xì)胞的各種大分子，如蛋白質(zhì)、多肽、核酸、多糖和磷脂等。1． 抗原用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測(cè)的分子可以是各種大分子，它們?cè)谶@一技術(shù)中扮演抗原的角色。它們可以是蛋白質(zhì)、多肽、核酸、多糖和磷脂等，最常見的待檢分子是蛋白質(zhì)、多肽。方法是利用分子生物學(xué)技術(shù)制備重組DNA時(shí)導(dǎo)入一段序列，該序列編碼一個(gè)多肽與重組蛋白質(zhì)連接在一起，該多肽作為抗原或半抗原能導(dǎo)致針對(duì)它的抗體產(chǎn)生。免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)的這種巧妙應(yīng)用，近來在研究新克隆得到的蛋白質(zhì)分子的定位中發(fā)揮很大作用，也為該技術(shù)開拓了更廣闊的應(yīng)用空間。在免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)中可以有兩個(gè)層次的抗體。3．免疫細(xì)胞化學(xué)中的標(biāo)記物 免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)是用已知的抗體檢測(cè)組織與細(xì)胞中相應(yīng)抗原的方法，但抗原抗體相結(jié)合的復(fù)合物在顯微鏡下是看不見的，必須用特殊的標(biāo)記物對(duì)抗體或抗原抗體復(fù)合物進(jìn)行標(biāo)記，才能使抗原抗體復(fù)合物在顯微鏡下具有可見性。2 酶 用酶標(biāo)記已知抗體，再與組織或細(xì)胞中的相應(yīng)抗原結(jié)合，利用酶細(xì)胞化學(xué)方法顯示該標(biāo)記酶以達(dá)到顯示抗原的目的。3 膠體金 將膠體金與抗體結(jié)合形成金標(biāo)記抗體，再與相應(yīng)的抗原結(jié)合，形成顯微鏡下可見的電子致密的金顆粒。 4 親和物質(zhì) 親和物質(zhì)是一種有多價(jià)能力的物質(zhì)，不僅與另一種親和物質(zhì)有高度的親和力，而且可與抗體蛋白及各種標(biāo)記物如熒光素、酶、膠體金等結(jié)合，因而可以通過熒光顯微鏡、酶加底物顯色反應(yīng)等定位某種特異分子。5 鐵蛋白 將鐵蛋白通過一種低分子的雙功能試劑與抗體相結(jié)合，它既保留了抗體的免疫活性又具有顯微鏡下可見的高電子密度核心。間接法：用未標(biāo)記的特異抗體（第一抗體）與組織中的抗原結(jié)合，再用標(biāo)記的第二抗體與第一抗體結(jié)合，間接檢測(cè)組織中的抗原。標(biāo)記抗體準(zhǔn)備 抗體標(biāo)記的基本方法是利用分子間電荷等作用力或使用交聯(lián)劑，將抗體與標(biāo)記物連接在一起。樣品制備 樣品固定時(shí)既要保存好組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)和抗原位置又要保存好抗原性。電鏡免疫細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)可在未經(jīng)包埋的組織片上進(jìn)行，稱包埋前技術(shù)；也可在超薄切片上進(jìn)行，稱包埋后技術(shù)。基本實(shí)驗(yàn)過程光鏡樣品 固定（抗原固定＋結(jié)構(gòu)固定）→ 冷凍切片或石蠟包埋切片→免疫細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)→ 光鏡觀察電鏡樣品（包埋前技術(shù)）固定（抗原固定＋結(jié)構(gòu)固定）→切組織片→免疫細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)→脫水包埋→超薄切片→電鏡觀察電鏡樣品（包埋后技術(shù)）固定（抗原固定＋結(jié)構(gòu)固定）→脫水包埋→超薄切片→免疫細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)→電鏡觀察三、放射自顯影技術(shù) 放射自顯影（radioautography）是利用放射性核素（同位素）的射線作用于感光材料的鹵化銀晶體，產(chǎn)生潛影，然后通過顯影過程把“像”顯示出來，以研究用放射性核素標(biāo)記的物質(zhì)在生物體內(nèi)的定位和定量的一種技術(shù)。光鏡放射自顯影研究同位素標(biāo)記物在組織和細(xì)胞中的分布；電鏡放射自顯影研究同位素標(biāo)記物在細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)水平上的分布。另外，也可以將放射性核素聯(lián)結(jié)到能與特異大分子結(jié)合的探針上，顯示特異大分子的定位和定量，如用35S標(biāo)記的脫氧胞嘧啶核苷參入探針DNA分子，通過原位雜交使這一放射性探針與特異DNA或RNA分子結(jié)合，再通過放射自顯影顯示特異核酸分子在組織或細(xì)胞內(nèi)的分布。 核子乳膠 核子乳膠是鹵化銀晶體在明膠中形成的懸浮體，顆粒細(xì)小而均勻，具較好的靈敏度，能精確地測(cè)定顯影顆粒的密度、離子射程和徑跡的擴(kuò)散。三種射線都能對(duì)感光材料發(fā)生作用，但情況各不相同。 射線對(duì)核子乳膠的作用 放射自顯影的過程和普通的照相過程很相似。這就是潛影形成的過程，再經(jīng)過顯影和定影，影像就呈現(xiàn)出來（圖27）?，F(xiàn)以電鏡放射自顯影為例作簡(jiǎn)單介紹。要研究大分子的代謝過程，所選擇的示蹤化合物必須是所研究大分子的前體。要研究已合成的大分子的定位，則可以通過酶促反應(yīng)令示蹤化合物參入探針，再通過原位雜交反應(yīng)令放射性探針與所要研究的大分子結(jié)合。 涂覆核子乳膠膜 在帶有放射性核素的切片上覆蓋一層核子乳膠膜，然后進(jìn)行自顯影過程。制備方法包括環(huán)套法、浸涂法、平基法等。自顯影過程一般在低溫（4℃）和干燥的條件下進(jìn)行。顯影的作用是使?jié)撚白兂刹环€(wěn)定的影像，而定影使已顯影的影像穩(wěn)定下來。這一技術(shù)不需要從組織細(xì)胞中提取核酸，對(duì)組織中含量極低的靶序列有很高的靈敏度，并可保持組織與細(xì)胞的結(jié)構(gòu)完整，反映特異核酸分子的定位。 （一）原位雜交技術(shù)的原理 原位雜交技術(shù)的原理是：使含有特異序列、經(jīng)過標(biāo)記的核酸單鏈即探針，在適宜條件下與組織細(xì)胞中的互補(bǔ)核酸單鏈即靶核酸發(fā)生雜交，再以放射自顯影或免疫細(xì)胞化學(xué)方法對(duì)標(biāo)記探針進(jìn)行探測(cè)，從而在細(xì)胞原位顯示特異的DNA或RNA分子。分子雜交技術(shù)利用的就是兩條互補(bǔ)的DNA單鏈能夠復(fù)性的性質(zhì)。這一過程相當(dāng)于DNA的復(fù)性，只是核酸單鏈的來源不同。 圖28 原位雜交原理圖參照前書圖27 探針標(biāo)記 探針是經(jīng)過標(biāo)記的核酸分子，與待測(cè)DNA或RNA序列互補(bǔ)。 探針標(biāo)記物有放射性的和非放射性的兩類。非放射性標(biāo)記物主要有熒光素、生物素、地高辛和溴脫氧尿嘧啶等。然后通過各種酶促反應(yīng)，如隨機(jī)引物法或PCR法，使標(biāo)記分子參入探針。雜交可發(fā)生于RNA與DNA、DNA與DNA、RNA與RNA之間。雜交體的探測(cè) 對(duì)雜交體的探測(cè)根據(jù)探針標(biāo)記物的不同而采用各種方法，目的是使標(biāo)記的雜交體在光鏡或電鏡下可見。方法是在切片上涂覆核子乳膠膜后置于暗盒中于4℃自顯影一段時(shí)間，然后經(jīng)顯影和定影后觀察銀離子在細(xì)胞和細(xì)胞器分布情況。也就是采用那些在光鏡或電鏡下具有可見性的免疫細(xì)胞化學(xué)標(biāo)記物來直接或間接地顯示雜交探針標(biāo)記物。 （二）實(shí)驗(yàn)方法 原位雜交技術(shù)的實(shí)驗(yàn)方法主要包括：標(biāo)記探針的準(zhǔn)備，組織樣品制備，雜交和雜交體探測(cè)。 2．組織樣品制備 光鏡原位雜交標(biāo)本的固定多使用4%多聚甲醛，常規(guī)石蠟包埋和切片，但在操作過程中應(yīng)提防RNA酶污染。與免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)一樣，電鏡水平的原位雜交可以在未經(jīng)包埋的組織切片上進(jìn)行，稱包埋前技術(shù)；也可以在超薄切片上進(jìn)行，稱包埋后技術(shù)。3． 雜交