理學(xué)酶工程ppt課件-在線瀏覽
2025-04-10 22:20本頁面
【正文】 和的程度，很多蛋白質(zhì)可以從水溶液中沉淀出來，這種現(xiàn)象稱為 鹽析 （ salting out）。當(dāng)除去鹽后，復(fù)可溶解。 2022/3/13 17 ? 不同的蛋白質(zhì)分子，由于其分子表面的極性基團(tuán)的種類、數(shù)目以及排布的不同，其水化層厚度不同，故鹽析所需要的鹽濃度也不一樣，因此調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)中鹽的濃度，可以使不同的蛋白質(zhì)分別沉淀。 ? PEG是一種特別有用的沉淀劑，因為無毒，不可燃性且對大多數(shù)蛋白質(zhì)有保護(hù)作用。 2022/3/13 19 3)有機(jī)溶劑沉淀法 —— 溶解度的差異 ?與水互溶的極性有機(jī)溶劑如 甲醇、乙醇、丙酮等能使蛋白質(zhì)在水中的溶解度顯著降低。若預(yù)先將有機(jī)溶劑冷卻至 0℃以下， 然后在不斷攪拌下將其逐漸加入蛋白質(zhì)溶液中，防止有機(jī)溶劑局部濃度過高，則在很大程度上解決變性問題。 2022/3/13 20 4）等電點沉淀法 —— 溶解度的差異 ? 蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，其溶解度與其凈電荷數(shù)量有關(guān)，隨溶液 pH變化而變化。 ? 不同的蛋白質(zhì)有不同的等電點，因此通過調(diào)節(jié)溶液 pH到目的蛋白的等電點，可使之沉淀而與其它蛋白質(zhì)分開，從而除去大量雜蛋白。 2022/3/13 21 5）熱變性沉淀法 —— 熱穩(wěn)定性的差異 適用于熱穩(wěn)定性酶。 可用其他輔助因子、底物等方法，使目的酶的熱變性溫度提高。 1）凝膠過濾層析： 分 離酶蛋白時， 分子大小 大于凝膠孔徑的蛋白被凝膠排阻，因而在凝膠顆粒間隙中移動，速度較快；小分子蛋白質(zhì)則可自由出入凝膠顆粒的小孔內(nèi)，路徑加長，移動緩慢。 2022/3/13 23 Gel 2022/3/13 24 2022/3/13 25 原理 :不同蛋白質(zhì)等電點不同 ,在同一 pH介質(zhì)中電離情況不同，分子所帶電荷不同 ,與離子交換劑的吸附能力不同 . 將離子交換樹脂裝入層析柱。陰離子交換基質(zhì)結(jié)合帶有負(fù)電荷的蛋白質(zhì)，陽離子交換基質(zhì)結(jié)合帶有正電荷的蛋白質(zhì) . 2） 離子交換層析法 Ion Exchange 2022/3/13 26 2022/3/13 27 離子交換層析的基本原理 ?物質(zhì)在樹脂上結(jié)合的牢固程度即親和力大小有差異，因此選用適當(dāng)?shù)南疵撘罕憧蓪⒒旌衔镏械慕M分逐個洗脫下來，達(dá)到分離純化的目的。 ? 將待純化物質(zhì)的特異配體通過適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)反應(yīng)共價的連接到載體上，待純化的物質(zhì)可被配體吸附，雜質(zhì)則不被吸附，通過洗脫雜質(zhì)即可除去。 3） 親和層析法 2022/3/13 29 利用對配體的特異生物學(xué)親和力的純化方法 親和色譜顆粒 具有極強的專一性 2022/3/13 31 親和層析的四個要素 Affinity 2022/3/13 32 4） 高效液相色譜層析（ HPLC） ? 特點： ①使用的固相支持劑顆粒很細(xì)，表面積很大 ,因而分辨率很高。 ? 許多類型的柱層析都可用 HPLC來代替，如分配層析、離子交換層析、吸附層析、凝膠過濾等。混合物中各組分性質(zhì)不同，因而它們在柱內(nèi)移動速度不同而逐漸分離。 區(qū)帶電泳 —— 樣品溶液在一惰性支持物上進(jìn)行電泳的過程。區(qū)帶的位置可用專一蛋白質(zhì)染料染色顯示，有些也可利用伴有顏色變化的酶催化反應(yīng)來顯示。 SDSPAGE（變性聚丙烯酰胺凝膠電泳） ?在凝膠與緩沖系統(tǒng)中加入陰離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉（ SDS），蛋白質(zhì)分子被大量 SDS陰離子包裹，消除了它們間原來攜帶的電荷差別，電泳時蛋白質(zhì)向正極移動。 一維電泳 2022/3/13 37 支持物：聚丙烯酰胺凝膠。 凝膠的孔隙大小通過適宜的濃度和加入交聯(lián)劑（亞甲基雙丙烯酰胺）加以控制 2022/3/13 38 電泳條帶 2022/3/13 39 水平板式電泳槽 2022/3/13 40 ? PAGE根據(jù)其有無濃縮效應(yīng) ， 分為 連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng) 兩大類 ， ? 連續(xù)系統(tǒng) 電泳體系中緩沖液 pH值及凝膠濃度相同 ， 帶電顆粒在電場作用下 ， 主要靠電荷和分子篩效應(yīng) 。 2022/3/13 41 ? 濃度梯度凝膠電泳 從凝膠頂部到底部丙烯酰胺的濃度呈梯度變化，如通常頂部凝膠濃度為 5％，底部凝膠濃度為 25％。 ? 另一個優(yōu)點是梯度凝膠可以分辨分子量相差較小，在單一濃度凝膠中不能分辨的蛋白質(zhì)。 ? 各種蛋白質(zhì)各自都有一個等電點 ,在一特殊的 pH環(huán)境中 ,蛋白質(zhì)分子呈電中性 ,在電場中不會遷移。 2022/3/13 44 常用支持介質(zhì) ：瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠，其中聚丙烯酰胺凝膠最常用 載體兩性電解質(zhì) :一系列 脂肪族多氨基多羧酸 同系物和異構(gòu)體，具有很多既不相同又十分接近相互連接的 pI值。 pH范圍： pH3~10 丙烯酸 +多乙烯多胺 →→→ Ampholine（ LKB） 加成反應(yīng) 2022/3/13 45 ㈠ 沒通電時的變化 所有的載體兩性電解質(zhì)分子都荷電 ， 只是溶液中荷正電和荷負(fù)電的基團(tuán)數(shù)目相等 ， 凈電荷為零 。 當(dāng)它達(dá)到凈電荷是零的位置時才停止 。
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