【正文】 ，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。（ 3）表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，體現(xiàn)了菌體生長(zhǎng)的經(jīng)濟(jì)原則 :不需要就不合成。結(jié)構(gòu)基因可以表達(dá)阻遏蛋白 (無活性 ) 酶蛋白mRNA代謝產(chǎn)物與阻遏蛋白結(jié)合 ,從而使阻遏蛋白能夠阻擋操縱基因 ,結(jié)構(gòu)基因不表達(dá)代謝產(chǎn)物調(diào)控方式 阻遏蛋白 添加物 與 操縱基因結(jié)合阻遏效應(yīng) 舉例酶的誘導(dǎo) 有 活性 － ＋ 不 轉(zhuǎn)錄，繼而不翻譯誘導(dǎo)物 － 轉(zhuǎn)錄，繼而翻譯乳糖操縱子酶的 阻遏 無 活性 －阻遏物 ＋ 不轉(zhuǎn)錄，繼而不翻譯色 氨酸操縱子酶 合成的誘導(dǎo)與阻遏操縱子模型調(diào)控作用對(duì)比? 指細(xì)胞內(nèi)同時(shí)有兩種分解底物（碳源或氮源）存在時(shí)，利用快的那種分解底物會(huì)阻遏利用慢的底物的有關(guān)酶合成的現(xiàn)象。分解代謝物阻遏現(xiàn)象：實(shí)驗(yàn)： 細(xì)菌在含有葡萄糖和乳糖的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，優(yōu)先利用葡萄糖。 這一現(xiàn)象又稱葡萄糖效應(yīng)，產(chǎn)生的原因是由于葡萄糖降解物阻遏了分解乳糖酶系的合成。分解代謝物阻遏R LacZ LacY LacamRNA mRNAZ mRNAY mRNAa 基 因 表達(dá)CAP基因 結(jié)構(gòu)基因TCAPOCAP結(jié)合部位CAPP葡萄糖分解代謝產(chǎn)物腺苷酸環(huán)化酶磷酸二酯酶ATPcAMP539。geneprotein）降低 cAMP濃度使 CAP呈失活狀態(tài)第二節(jié) tV（初速度）[P]t開始一段時(shí)間內(nèi)反應(yīng)速度幾乎維持恒定 ，即 產(chǎn)物生成量與時(shí)間成直線關(guān)系一、酶反應(yīng)初速度的測(cè)定? 為正確測(cè)量酶促反應(yīng)速度并避免干擾就必須測(cè)定反應(yīng)初期干擾因素還來不及起作用時(shí)的速度，稱之為 反應(yīng)初速度 。二、底物濃度對(duì)反應(yīng)速度的影響—— Km和 vmax的測(cè)定底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響? 在低底物濃度時(shí) ,? 當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到一定值，幾乎所有的酶都與底物結(jié)合后，反應(yīng)速度達(dá)到最大值（ Vmax），此時(shí)再增加底物濃度，反應(yīng)速度不再增加，表現(xiàn)為零級(jí)反應(yīng)。v = k [S]零級(jí)反應(yīng)[E]混合級(jí)反應(yīng)單分子酶促反應(yīng)的米氏方程及 Km推導(dǎo) 原則 ： 從酶被底物飽和的現(xiàn)象出發(fā)，按照米氏方程 :米氏常數(shù) :k4酶反應(yīng)速度與底物濃度的關(guān)系曲線* 當(dāng) v=Vmax/2時(shí)， Km=[S]（ Km的單位為濃度單位）* 是酶在一定條件下的特征物理常數(shù)，通過測(cè)定 Km的數(shù)值，可鑒別酶。VmaxVmax不準(zhǔn)，且點(diǎn)也要多。(1).在達(dá)到最適溫度以前，反應(yīng)速度隨溫度升高而加快? ?酶的最適溫度不是一個(gè)固定不變的常數(shù)?2.? 反應(yīng)活化能的一般測(cè)定方法是測(cè)定不同溫度下的反應(yīng)速率常數(shù)，根據(jù)阿累尼烏斯公式：? lnk=lnAEa/RT? 以 lnk對(duì) 1/T作圖，圖像為直線，其斜率為 Ea/R，從而計(jì)算出 Ea。pH）。Mg2+、 Cu2+、 Mn2+、 Zn2+、 Se3+Co2+、 Fe2+? 陰離子： ? 有機(jī)分子 還原劑：抗壞血酸、半胱氨酸、谷胱甘肽 ? 金屬螯合劑： EDTA凡是使酶的必需基團(tuán)或酶的活性部位中的基團(tuán)的化學(xué)性質(zhì)改變而降低酶活力甚至使酶完全喪失活性的物質(zhì)，叫酶的 抑制劑 （ inhibitor） 抑制劑對(duì)酶作用的影響抑制劑類型和特點(diǎn) 專一性不可逆抑制劑抑制劑與酶的必須基團(tuán)以共價(jià)鍵結(jié)合而引起酶活力喪失，不能用透析、超濾等物理方法除去抑制劑而使酶復(fù)活，稱 不可逆抑制（irreversible inhibition）。+IEIES P+抑制劑（ I）和底物（ S）競(jìng)爭(zhēng)酶的結(jié)合部位，從而影響了底物與酶的正常結(jié)合。大多數(shù)競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的結(jié)構(gòu)與底物結(jié)構(gòu)類似如： 丙二酸是琥珀酸脫氫酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用+IEI+S ESIES P+酶與抑制劑結(jié)合后還可以與底物結(jié)合；酶與底物結(jié)合后還可以與抑制劑結(jié)合。這類抑制劑與酶活性部位以外的基團(tuán)相結(jié)合，其結(jié)構(gòu)與底物無共同之處，這種抑制作用不能用增加底物濃度來解除抑制，故稱 非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。非競(jìng)爭(zhēng)性抑制曲線非競(jìng)爭(zhēng)性抑制中， Vmax變小，Km不變，即在底物濃度不變情況下，降低了反應(yīng)的最大速率。EE+S+I作用特點(diǎn)：酶只有與底物結(jié)合后，才能與抑制劑結(jié)合。 游離酶的缺點(diǎn)：? ，穩(wěn)定性差（熱、酸堿、有機(jī)溶劑對(duì)其有影響）。? 。 (immobilized水溶性酶 水不溶性載體水不溶性酶（固定化酶）固定化技術(shù)什么是固定化酶？? 優(yōu)點(diǎn)：? (1)可提高穩(wěn)定性。? 缺點(diǎn)：? (1)存在擴(kuò)散限制。? (2)酶活性下降。固定化細(xì)胞（ immobilized? ? (2)既可作為單一酶，也可作為復(fù)合酶系完成部分代謝過程。局限性：? (1)細(xì)胞內(nèi)多種酶的存在，會(huì)形成不需要的副產(chǎn)物。? (2)原生質(zhì)體不穩(wěn)定，容易破裂，固定化后，由于載體的保護(hù)作用，穩(wěn)定性提高。二、固定化方法（ adsorption）? adsortion）? 作用力： 氫鍵、疏水鍵? 常用載體： 氧化鋁、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、 ? 2）離子結(jié)合法（ ion缺點(diǎn)： 結(jié)合力弱，易解吸附 。orcoupling） 親和性好，機(jī)械性能差? 瓊脂糖 ? 機(jī)械性能好，但有疏水結(jié)構(gòu)? 尼龍2）偶聯(lián)方法：? 偶聯(lián)成功與否取決于： ? 載體： 功能基團(tuán)：芳香氨基，羧基，羧甲基等。 ? 常用的偶聯(lián)反應(yīng)有：? 重氮化法 。? 溴化氰法 。? 優(yōu)點(diǎn)： 酶與載體結(jié)合牢固，不會(huì)輕易脫落，可連續(xù)使用。? ? 雙功能試劑：? 常用的是戊二醛 （ crosslinking）—————— 此法與共價(jià)偶聯(lián)法利用的均是共價(jià)鍵，不同之處： 交聯(lián)法不使用載體 。? ? ? (2)制備的固定化酶顆粒較小，給使用帶來不便。包埋法（ entrapment）? 將酶用物理的方法包埋在各種載體（高聚物）內(nèi)。? 微囊型： 將酶包埋在高分子半透膜中。半透膜：直徑幾十微米到幾百微米，厚約 25nm。? 與網(wǎng)格型包埋法相比，微囊型包埋法的 優(yōu)點(diǎn)：? 1）固定化酶 顆粒小 ，有利于底物和產(chǎn)物擴(kuò)散。 ? ? 缺點(diǎn)： 只適合作用于小分子底物和產(chǎn)物的酶。吸附法 交聯(lián)法 包埋法 酶的四種固定化方法固定化方法 吸附法 包埋法 共價(jià)結(jié)合法交聯(lián)法物理吸附法 離子吸附法制備難易 易 易 較難 難 較難結(jié)合程度 弱 中等 強(qiáng) 強(qiáng) 強(qiáng)活力回收 高，酶易流失高 高 低 中等再生 可能 可能 不能 不能 不能費(fèi)用 低 低 低 高 中等底物專一性 不變 不變 不變 可變 可變各種酶固定化方法的優(yōu)缺點(diǎn)比較分類方式 固定化細(xì)胞 分類方式 固定化細(xì)胞細(xì)胞類型 微生物植物動(dòng)物生理狀態(tài) 死細(xì)胞 :完整細(xì)胞 ,細(xì)胞碎片 , 細(xì)胞器活細(xì)胞 :增殖細(xì)胞 ,靜止細(xì)胞 , 饑餓細(xì)胞（二）細(xì)胞的固定化方法 2.直接固定法 ? 一般只用于單酶或少數(shù)幾種酶催化的反應(yīng)。在 5080℃ 加熱 10分鐘，使菌體自溶作用的酶失活，而葡萄糖異構(gòu)酶仍然保持活性，長(zhǎng)期使用酶活力不減少。 70再冷卻到 +10% 左右的細(xì)菌菌體 (預(yù)熱到 42℃ ）4取出后切成 33mm的小顆粒 常用凝膠：瓊脂凝膠，海藻酸鈣凝膠，角叉菜膠和光交聯(lián)樹脂。（三）原生質(zhì)體的固定化方法 二、固定化酶和固定化細(xì)胞的性質(zhì)與表征? 影響酶催化活性的因素? 1.分配效應(yīng)和擴(kuò)散限制效應(yīng)? 酶的活性 通常低于天然酶（有例外）。? 2.? 如：氨基酰化酶，? 天然酶， 70℃ ， 15分鐘，酶失去活性。70℃ ， 15分鐘，有 80% 活性。