酶聯(lián)免疫分析技術(shù)ppt課件-在線瀏覽
2025-02-22 20:20本頁(yè)面
【正文】 熒光 黃色 360,450 420 2022813 酶及底物 HRP的底物 DH2+ H2O2 D+ 2H2O 上式中， DH 2為供氧體， H2O 2為受氫體。 DH2如：鄰苯二胺 (OPD)、 四甲基聯(lián)苯胺 (TMB)和 ABTS 。 E TMB經(jīng) HRP作用后共產(chǎn)物顯藍(lán)色。酶反應(yīng)終止后， TMB產(chǎn)物由藍(lán)色呈黃色，可在比色計(jì)中定量，最適吸收波長(zhǎng) 為 450nm。 HRP對(duì)氫受體的專(zhuān)一性很高，僅作用于 H2O小分醇的過(guò)氧 化物和尿素過(guò)氧化物 (urea peroxide)。 液的最終體積而異，在板式 ELISA中一般采用 2mol/L。產(chǎn)物為黃色的對(duì)硝基酚，在 405nm波長(zhǎng)處 有吸收峰。 AP也有發(fā)熒光底物（磷酸 4甲基傘酮），可用 于 ELISA作熒光測(cè)定，敏感度較高于用顯色底物的 比色法。 陽(yáng)性對(duì)照品的基本組成應(yīng)盡量與檢測(cè)標(biāo)本的組成相一致，多 以含蛋白保護(hù)劑的緩沖液為基質(zhì)。 陰性對(duì)照品須先行檢測(cè)確定不含待測(cè)物質(zhì)。 酶免疫測(cè)定操作中的注意事項(xiàng) ? 試劑準(zhǔn)備 ? ? ? ? ? ? ? 加樣 溫育 洗板 顯色 比色 結(jié)果判斷 結(jié)果報(bào)告及解釋 標(biāo)本的采取和保存 ? 標(biāo)本為血漿和血清均可，血清標(biāo)本應(yīng)注意避免溶血，紅 細(xì)胞溶解時(shí)會(huì)釋放出具有過(guò)氧化物酶活性的物質(zhì)，以 HRP為標(biāo) 記的 ELISA測(cè)定中，溶血標(biāo)本可能會(huì)增加非特異性顯色，出現(xiàn) 假陽(yáng)性反應(yīng)。 如有細(xì)菌污染，菌體中可能含有內(nèi)源性 HRP，也會(huì)產(chǎn)生 假陽(yáng)性反應(yīng)。 5天內(nèi)測(cè)定的血清標(biāo)本可放置于 4℃ ， 超過(guò)一周測(cè)定的需低溫冰存。 6 試劑的準(zhǔn)備 從冰箱中取出的試驗(yàn)用試劑應(yīng)待溫度 與室溫平衡后使用。 同時(shí)應(yīng) 將相應(yīng)的質(zhì)控取出待溫度達(dá)到與室溫平衡。 所用蒸餾水或去離子水應(yīng)保證質(zhì)量。以抗體包被的夾心法為例，加入板孔 中的標(biāo)本和酶標(biāo)記抗體，其中的抗原并不是都有均等 的和固相抗結(jié)合的機(jī)會(huì)，只有最貼近孔壁的一層溶液 中的抗原直接與抗體接觸。這 就 是為 什么 ELISA反應(yīng)總是需要一定時(shí)間的溫育。 ? “邊緣效應(yīng) ” 的排除 : 使用水浴或在將反應(yīng)溶液加 入至板孔中時(shí)，將板和溶液均加熱至溫育溫度（如 37℃ ），就可以很容易地排除 “ 邊緣效應(yīng) ” ，并且 可提高測(cè)定的重復(fù)性。 37℃ 是實(shí)驗(yàn)室中常用的保溫溫度， 也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度。 為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋。 室 溫 溫 育 的 反 應(yīng) ， 操 作 時(shí) 的 室溫 應(yīng) 嚴(yán)格 限 制 在 規(guī) 定 的 范圍 內(nèi) ， 標(biāo)準(zhǔn) 室 溫溫 度 是指 2025℃ ， 應(yīng)注 意 溫育的溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。 加樣 ELISA中一般有 3次加樣步聚：即加標(biāo)本，加酶 結(jié)合物，加底物。 加標(biāo)本一般用微量加樣器，按規(guī)定的量加入板孔中。 然 后 在 微 型 震 蕩 器 上 震 蕩 1分 鐘 以 保 證 充分混和。 從滴瓶中滴加試劑，除了要注意滴加角度外，滴加速度也很重要，滴 加太快，很容易出現(xiàn)重復(fù)滴加或加在兩孔之間的現(xiàn)象，這樣就會(huì)在孔 內(nèi)的非包被區(qū)出現(xiàn)非特異吸附，從而引起非特異顯色。 ELSIA洗滌：達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。 可以說(shuō)在 ELISA操作中，洗滌是 最主要的關(guān)鍵技術(shù) 。 洗板液一般為含 % Tween20的中性 PBS。 洗滌作用機(jī)理，借助其疏水基團(tuán)與固相上蛋白的疏水基 團(tuán)形成疏水鍵，從而削弱蛋白與固相的吸附，同時(shí)在其 親水基團(tuán)與液相中水分子的結(jié)合作用下 ，促使蛋白質(zhì)脫 離固相而進(jìn)入液相 ? 洗 板 液 中 Tween20 濃 度 高 于 % ， 可 使 包 被 于 固 相 上 的 抗原或抗體解吸附而影響試驗(yàn)測(cè)定下限。反應(yīng)的 溫度和時(shí)間 仍是 影響顯色的因素。 注意： OPD底物顯色一般在 37℃ 反應(yīng) 2030分鐘 后即不再加深，再延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，可使本底值增高。 顯 色 ? 加入底物 A和 B后，應(yīng)振蕩混勻 ? ? 當(dāng)?shù)孜餅? OPD時(shí)，顯色反應(yīng)應(yīng)避光進(jìn)行 一般商品試劑盒顯色反應(yīng)條件為 37 ℃ 或室溫 反應(yīng) 15～ 30 min。 因此，為使弱陽(yáng)性樣本孔能有充分的顯色， 建議在 37℃ 下反應(yīng) 25～ 30分鐘后，終止反應(yīng) 比色測(cè)定。 但 為保 證 實(shí) 驗(yàn) 結(jié) 果 的穩(wěn)定性，宜在規(guī)定的適當(dāng)時(shí)間閱讀結(jié)果。 TMB 的終止液有多種，疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉 （ SDS ）等酶抑制劑均可使反應(yīng)終止能使藍(lán)色維 持較長(zhǎng)時(shí)間。 比色 ? 加酸終止顯色反應(yīng)后，比色測(cè)定前應(yīng)振蕩混勻 ? 先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標(biāo)比色儀 的比色架中，正確選擇波長(zhǎng)和參比波長(zhǎng)。例如 OPD 用 492nm 為 W1 ， 630nm 為 W2 ，最終測(cè)得 的 A 值為兩者之差（ W1W2 ）。 ? 各種酶標(biāo)儀性能有所不同，使用中應(yīng)詳細(xì)閱讀說(shuō)明書(shū)。優(yōu)良的酶標(biāo)儀的讀數(shù)一般可精確到 ，準(zhǔn)確性為 177。操作時(shí)室溫宜在 1530℃ ，使用前先預(yù)熱儀器 1530 分鐘， 測(cè)讀結(jié)果 更穩(wěn)定。在競(jìng)爭(zhēng)法 ELISA中則相反，陰性孔呈色深于 陽(yáng)性孔。 “ 陽(yáng)性 ” 表示該標(biāo)本在該測(cè)定系 統(tǒng)中有反應(yīng)。用定性判斷法也可
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