【正文】 的 1/10～ 1/20 6． 穩(wěn)定性 —— 確保所有樣品準(zhǔn)確測定 7． 提取回收率 —— 確保準(zhǔn)確度 第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求 2021/11/10 體內(nèi)藥物分析 26 一、方法特異性 (專屬性或選擇性 ) 方法的特異性 (specificity) —— 又稱專屬性或?qū)Ｒ恍?， 通常與選擇性 (selectivity)互用 —— 系指當(dāng)有內(nèi)源性物質(zhì)存在時 ， 方法準(zhǔn)確測定待測物質(zhì)的能力 專屬性 —— 表示所檢測的 信號 (響應(yīng) )系屬于 待測藥物所特有 的 選擇性 —— 系指將待測物質(zhì)與其代謝物及同服的其它藥物加以 區(qū)分 (分離 )的能力 特異性 —— 函蓋二者 ， 以 驗證 所測定的物質(zhì)與待測藥物的 同一性 考察一個分析方法是否具有特異性 ， 應(yīng)著重考慮以下幾點(diǎn)： 第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求 2021/11/10 體內(nèi)藥物分析 27 1. 內(nèi)源性物質(zhì)的干擾 比較 —— 待測藥物或其活性代謝產(chǎn)物檢測信號 對照品 （ 或標(biāo)準(zhǔn)品 ） 空白生物基質(zhì) 模擬生物樣品 （ 空白生物基質(zhì)中添加對照品 ） —— 如 HPLC色譜峰的 tR、 n 和 T 是否一致 及與內(nèi)源性物質(zhì)色譜峰的 R 確證 —— 內(nèi)源性物質(zhì)對分析方法有無干擾 第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求 2021/11/10 體內(nèi)藥物分析 28 2. 代謝產(chǎn)物的干擾 比較 —— 模擬生物樣品和用藥后的實際生物樣品的檢測信號 與代謝產(chǎn)物 (在實際樣品中 tR 隨 時間延長而增加 )的 R 如 HPLC色譜峰的 tR、 n 和 T 〔 或改變色譜條件 (色譜柱 )再比較 〕 確證 —— 其它代謝產(chǎn)物對分析方法有無干擾 結(jié)構(gòu)已知的特定活性代謝物的測定 —— 必要時通過 HPLCDAD和 LCMS確證色譜峰的單純性和同一性 對于結(jié)構(gòu)未知的代謝產(chǎn)物的測定 —— 可采用 LCLCNMR進(jìn)行結(jié)構(gòu)的初步推測后 ， 考察其干擾情況 第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求 2021/11/10 體內(nèi)藥物分析 29 3. 伍用藥物的干擾 TDM 時 —— 還要考慮患者可能同時服用藥物 (通常為數(shù)有限 )的干擾 比較 —— 待測藥物及可能同時服用藥物的模擬生物樣品的 檢測信號 —— 如 HPLC色譜峰的 tR、 n 和 T 是否一致 確證 —— 同時服用藥物對分析方法的 干擾情況 第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求 2021/11/10 體內(nèi)藥物分析 30 4. 與參比方法的相關(guān)性 除上述方法外 ， 有時還可使用參比方法對照 參比方法 一般選用特異性強(qiáng) 、 準(zhǔn)確度高 、 線性關(guān)系良好的色譜法 —— 如在 TDM中使用 UV(或 RIA)時 , 可以 HPLC(或 GC)為參比 參比方法測定結(jié)果為橫坐標(biāo) (X)。 但應(yīng)有確切原因 ， 如： —— 樣品處理有損失 、 色譜圖有問題 ， 或 —— 顯著偏離標(biāo)準(zhǔn)曲線 〔 該數(shù)據(jù)參與標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸后 ， 計算 QC樣品或返算該點(diǎn)濃度時顯著偏離其標(biāo)稱濃度 (配制濃度 )〕 —— 其余 應(yīng)有至少 5個濃度點(diǎn)在標(biāo)準(zhǔn)曲線上 第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求 2021/11/10 體內(nèi)藥物分析 38 5. 加權(quán)最小二乘法 最小二乘法 —— 每個濃度點(diǎn) 絕對誤差 (yi－ yi’)賦予同等的重要性 標(biāo)準(zhǔn)曲線上的高低濃度相差懸殊 (范圍達(dá) 102) —— 低濃度區(qū)的計算值相對誤差過大 ， 難以滿足規(guī)定要求 加權(quán)最小二乘法 —— 回歸計算時增加一個 權(quán)重因子 (w) —— 各濃度的響應(yīng)值與回歸值的相對離差平方和達(dá)到最小 式中 ， wi為標(biāo)準(zhǔn)曲線上第 i個濃度點(diǎn)的權(quán)重因子 ? ???????? ? 239。i ii y yy? ? 2)39。( ii yy第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求 2021/11/10 體內(nèi)藥物分析 39 1）回歸方程 (y = a + b x)參數(shù)的計算 ? ?? ? ?? ? ? ???????22biiiiiiiiiiiiixwxwwywxwyxww? ?? ? ?? ?? ? ??????222aiiiiiiiiiiiiiixwxwwyxwxwywxw?? ???iiiiiwxwyw ba 或，? ?? ?? ? ?? ? ?????22//riiiiiiiiiiwywywwywbxaw第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求 2021/11/10 體內(nèi)藥物分析 40 2）權(quán)重因子的選擇 加權(quán) —— 賦予低濃度點(diǎn)以更大的權(quán)重 在實際工作中的一般方法 —— 當(dāng) wi=1/(yi’)2時 ， 則 —— 而 yi與 xi成正比 —— 所以 ， 令 wi=1/(bxi)2=k/xi2 (通常取 wi=1/C2) 當(dāng) 高濃度點(diǎn) 測量值的準(zhǔn)確度 下降過大 —— 低濃度點(diǎn)權(quán)重過大 ， 降低 低濃度點(diǎn)的 權(quán)重 ， wi=k/xi ? ? 2)39。 39。 15% (LOQ附近為 177。 第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求 2021/11/10 體內(nèi)藥物分析 50 五、定量限 方法定量限 (limit of quantitation， LOQ) —— 系指在保證具有一定可靠性 (準(zhǔn)確度與精密度符合要求 )的前提下 ， 能測定出生物樣品中藥物的最低濃度 —— 又稱為方法靈敏度 (sensitivity) —— 標(biāo)準(zhǔn)曲線上的最低濃度點(diǎn) (最低濃度點(diǎn) ≥LOQ) 要求 —— 應(yīng)能滿足測定 3～ 5個消除半衰期后生物樣品中的藥物濃度 —— 準(zhǔn)確度在 80%～ 120%(或 RE在 177。 15%范圍內(nèi) )， RSD＜ 15% 第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求 2021/11/10 體內(nèi)藥物分析 52 七、萃取回收率 生物樣品的預(yù)處理方法 —— 重點(diǎn)考慮 方法準(zhǔn)確度 (或 相對回收率 )， 操作簡便 、 快速 —— 萃取回收率 (絕對回收率 ， absolute recovery)， ≥70% 萃取回收率與相對回收率的意義不同 萃取回收率 —— 考察生物樣品預(yù)處理過程造成的藥物的程度損失 相對回收率 —— 采用標(biāo)準(zhǔn)曲線可準(zhǔn)確計算生物樣品中藥物濃度 第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求 2021/11/10 體內(nèi)藥物分析 53 1. 測定法 取空白生物基質(zhì) (如血漿 )， 照準(zhǔn)確度項下方法 ， 制備高 、 中 、 低3個濃度的 QC樣品 (每一濃度至少 5個樣品 )， 每個樣品分析測定 1次 另取等量的相同 3個濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液 ， 用溶解模擬生物樣品經(jīng)提取處理后的殘渣的溶劑稀釋至同體積 ， 同法測定 AT—— 經(jīng)萃取后的 QC樣品的檢測信號或比值 (內(nèi)標(biāo)法 ) AS—— 未經(jīng)萃取的標(biāo)準(zhǔn)溶液的檢測信號或比值 (內(nèi)標(biāo)法 ) ）（ %100??STAAR第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求 2021/11/10 體內(nèi)藥物分析 54 2. 限度要求 萃取回收率一般應(yīng) ≥50% 高 、 中濃度的 RSD應(yīng) ≤15% 低濃度的 RSD應(yīng) ≤20%。 第四章 分析方法的建立與驗證 NOFNNOO H, H Cl , H 2 O2021/11/10 體內(nèi)藥物分析 56 藥動學(xué)參數(shù) 吸收過程 —— 空腹口服后吸收迅速 、 人體生物利用度約為 49%～ 70% Cmax —— 口服 500mg后平均 Cmax為 ～ Tmax —— 1～ 2h T1/2 —— 血中 T1/2約為 4h， 腎功能減退時稍有延長至 6h 蛋白結(jié)合率 —— 20%～ 40% 代謝 —— 口服給藥 24h內(nèi) ， 40%～ 50%原形 、 15%代謝物經(jīng)腎排出 第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求 2021/11/10 體內(nèi)藥物分析 57 體內(nèi)分析方法 RPHPLC 色譜柱 —— ODS色譜柱 流動相 —— 甲醇 (乙腈 )磷酸 (枸櫞酸 )緩沖液 (三乙胺調(diào)節(jié) ～)， 或 離子對色譜 : 溴化十六烷基三甲基銨 (氫氧化四丁基銨 ) 檢測 —— 紫外或熒光檢測 生物樣品預(yù)處理 蛋白沉淀法 —— 甲醇 、 乙腈或高氯酸沉淀蛋白后直接進(jìn)樣 溶劑萃取法 —— 二氯甲烷 異丙醇 、 氯仿 異丙醇混合溶劑 蛋白沉淀 溶劑萃取 —— 乙腈沉淀蛋白后二氯甲烷 異丙醇提取 第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求 2021/11/10 體內(nèi)藥物分析 58 二、分析方法設(shè)計 1． 分析方法 血漿蛋白結(jié)合率低 (20%～ 40%)、 以原形從腎排泄 生物等效性研究 —— 測定血漿中環(huán)丙沙星原形藥物的濃度 時間曲線 。 第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求 2021/11/10 體內(nèi)藥物分析 63 三、實驗方案（續(xù)） 3． 血樣分析法 血漿樣品的預(yù)處理 取血漿 ， 加內(nèi)標(biāo)溶液 (10?g/ml諾氟沙星甲醇溶液 ） 50