【正文】 種帶有不同的C末端氨基酸 種類 的 PC，分別是：（ γ谷氨酸 半胱氨酸） nGly， (γ谷氨酸 半胱氨酸）nGly， （ γ谷氨酸 半胱氨酸） βAla，（ γ谷氨酸 半胱氨酸） nser 和（ γ谷氨酸 半胱氨酸） n。其機理是：重金屬離子植 物吸收到體內(nèi)后，與細(xì)胞內(nèi)的 PC 作用構(gòu)成復(fù)合物 ， 而后轉(zhuǎn)運到特定的細(xì)胞器 ( 特別是液泡 )，然后區(qū)室化絡(luò)合 ， 降低細(xì)胞質(zhì)中有毒的金屬離子的濃度。其中，柱前衍生液相色譜熒光法的優(yōu)點是能測定不同種類的 PC，但是衍生試劑難購買到，并且衍生過程復(fù)雜 ； 電化學(xué)法和電泳法可測定總的 PC，但不能確定不同作物的 PC 的類型 ； 而高效液相色譜 氨基酸自動分析聯(lián)用方式難達(dá)成 ； 高靈敏度液相色譜 質(zhì)譜 法，具有分離率高，可在多肽復(fù)合物測定 PC 結(jié)構(gòu)鑒定等優(yōu)點，成為 PC 的主要測定方法。螯合效應(yīng)是指在植物中的 PC 利用高親和力螯合金屬離子，金屬濃度降低后，植物重金屬毒性有所削弱。 PC 的合成需要金屬離子的誘導(dǎo) 2 PC 的合成可被金屬離子激活 ， 因為酶的活性能被金屬離子誘導(dǎo)。曾有學(xué)者用實驗測定了金屬離子對 PC 的合成的誘導(dǎo)能力比較 ， 結(jié)果顯示其中 Cd2+對 PC 合成的影響最大，同時 Ni2+、 Cd2+、 Cu2+、 Hg2+、Ag+、 Sn2+、 Zn2+、 Sb3+、 P2+、 Au+均可誘導(dǎo) PC 合成，然而將激活劑金屬離子濃度降低或者是外加金屬螯合劑 ( 例如 EDTA)時， PC 的合成就會被迫停止，這說明 PC 生物合成需要金屬離子的誘導(dǎo)，同時實驗表明不同金屬對 PC 誘導(dǎo)作用在不同種植物中有不同的強度。在這個地區(qū)，一個分子的 PC 合酶催化另一種分子 GSH 合成 PC2， PC2 可以繼續(xù)被 GSH 催化，使 Glu+Cys γGluCys+Gly γGCS GSH GS PCS+ Cd2+ PC 3 PC3 進(jìn)一步合成。研究人員發(fā)現(xiàn)，吃蘑菇的美味牛肝菌（牛肝菌）通過 PC 螯合 Cd（ Collin 漢森 2021），當(dāng)線蟲 cepcs3 和煙草耐 Cd 能力改進(jìn)以后，胞漿中 PC／ CD 所占的比重也增加了。 PC 解除重金屬的毒害作用機理 植物螯合肽的功 能主要是通過絡(luò)合重金屬與將重金屬區(qū)室化來減輕重金屬對細(xì)胞的毒害，多數(shù)金屬離子都能被 PC 絡(luò)合，但是研究較清楚的是植物螯合肽與金屬Cd 的絡(luò)合機制，并且日前分離出的 PC 大多是 PCCd 型復(fù)合物。植物對 Cd2+解毒方法可以分為硫含量低的 PcCd 復(fù)合物的跨液泡膜轉(zhuǎn)運、硫離子在液泡中的累積導(dǎo)致的含硫量高的 pCCdS 形成這兩種方式。研究還發(fā)現(xiàn)在酸性環(huán)境下，液泡中的 HMW 復(fù)合物上的金屬離子還能和檸檬酸、蘋果酸相結(jié)合， 4 失去金屬離子的 PC 分解成形成氨基酸 ， 又返回細(xì)胞質(zhì)中參與 PC 的合 成 。 該實驗所用的實驗儀器有：配備二極管陣列檢測器 ； 色譜儀 (美國公司 )； 單極質(zhì)譜聯(lián)用儀 (美國公司 ) ； 有 50mm、 1 mm、 規(guī)格的 C18 色譜柱（美國公司 )，配有電霧化學(xué)源，質(zhì)譜工作站。 花生中 PC 的提取 根據(jù) sneller（ 2021）的方法，把花生鮮樣用液氮在研缽中磨碎，然后冷凍干燥達(dá)70 小時，冷凍干燥以后稱量約 的花生，再加入 7mL 的 % TFA（含， PH1)，充分振蕩 30min ，然后 4 度下， 在約 10000 r/m in 離心率下離心 20 m i n ， 吸取上清液以備待測用。 花生中 GSH， PC 等總含量的測定 配置含 mmol /L 的埃爾曼試劑試劑顯色劑 (含 mmol /L 的 DTPA)的 200 mmol /L 的 HEPPS 緩沖液（ pH = ），避光保存 ， 取花生組織提取液 300 L 加到 300L DTNB 顯色劑中，混勻后在 30℃下反應(yīng) 3 min，其中 GSH， PC 和 TNB 會發(fā)生反應(yīng)，生成黃色化合物，非蛋白巰基化 合物與黃色化合物含量符合 1:1 的 比例關(guān)系， 依據(jù)有差別的花生樣品在 420 nm下的吸光度值不同，便可計算出花生樣品中巰基含量。柱前衍生化反應(yīng)為將 10 L 25mmol/ L 的 mBBr 和 670 L 200 mmol/LHEPPS(pH = )加到 300L 的 4 種標(biāo)準(zhǔn)液和植物組織上清液中，充分混合 ， 37℃孵化反應(yīng) 40min，于 200 L 的 1 mmol/L MSA 激波旋渦抖動，停止反應(yīng)，并作試劑空白的衍生反應(yīng)，反應(yīng)液在 4℃冰箱避光保存，等待高效液相色譜法測定。 表 淋洗梯度 時間（ M） 三氟乙酸 (0. 1%) 乙腈 (色譜純 ) 流速（ ） 0 100 20 10 100 20 40 20 100 60 100 20 （ 2）質(zhì)譜條件 ： 柱子型號為 SB C18； 電噴霧電離的方式，噴霧電壓 ： kV； 掃描范圍是 ： m / z 6001500； 錐電壓為 ： 25 V； 采樣錐電壓： 20 V； 溶劑氣體溫度為： 360℃ ；采樣錐電壓： 20 V； 氣體溫度和溶劑： 360℃ ； 脫溶劑氣流量 ： 110m L /h。 見圖 0 10 20 30 40 t/min 圖 混合樣品中標(biāo)準(zhǔn) PC， GSH化合物的色譜分離 鎘對花生體內(nèi) PC 和 GSH含量和 PCs 狀態(tài)的影響 由圖 可得到，在濃度為 60 mol/L 的 Cd 的脅迫作用下，花生體內(nèi) GSH 與未加毒的比較相比含量無有明顯差別，這是由于土壤環(huán)境中有 Fe 或者 Zn 等金屬 離子的 存在使得在無 Cd 的對照組中也檢測到 了 PC2 ，通過設(shè)置多重比較，可知，花生經(jīng) Cd 處理后誘 導(dǎo)花生產(chǎn)生了 PC4，在 Cd 的影響下花生體內(nèi)產(chǎn)生的含量最大的是PC3， PC4 與 PC2 含量沒有明顯的差異。優(yōu)化正離子 9 掃描條件下 各種條件，例如錐電壓為 ： 25 V； 噴霧電壓為 ： kV； 溶劑氣體溫度的去除： 350℃ ； 采樣錐電壓 ： 20 V； 透鏡電壓 V； 錐孔溫度為 ： 105℃ ； 脫溶劑氣流量為 ： 110m L/h ； 全掃描范圍 m /z 為 ： 5001200，反吹氣流量為 ： 80m L /h。 圖 PC 的總離子流圖 圖 正離子質(zhì)譜圖 10 PC4 分子式為 (γG l uCys) 4βA la ，分子量為 。 線性范圍和檢出限 將 PC 標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成濃度為 、 、 5 .0、 和 /L 的梯度溶液，用色譜 質(zhì)譜方式測定，橫坐標(biāo)用標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度表示，縱坐標(biāo)用峰面積表示，繪制這個條件下標(biāo)準(zhǔn)線性回歸曲線。 回收率和精密度 選用統(tǒng)一花生樣品進(jìn)行重復(fù)的精密度實驗，同時設(shè)置試劑作為空白，結(jié)果見表 ， 結(jié)果表明， 本方法對濃度 水平為 /kg 的樣品中 ，測定的 PC4 平均回收率達(dá) % ； 相對標(biāo)準(zhǔn)偏差達(dá) %。 表格 實驗的回收率與精密度的分析結(jié)果 ( n = 3) NUMBER 分析結(jié)果 mg/kg 回收率 (%) RSD 1 2 3 實際花生樣品的分析 選用 HPLCMS 檢測方法，在兩種不同鎘水平下測定了兩個花生品種。文獻(xiàn)表明，含（ γ谷氨酸 半胱氨酸）植物螯合肽的 Nβ丙氨酸肽鏈結(jié)構(gòu)，有豆類，但沒有報告花生中包含植物螯合肽。 表 花生樣品中植物螯合肽測定結(jié)果 第 1組 PC4含量 (mg/kg) 第 2組 PC4含量 （ mg/kg） 圖 花生樣品中 PC4的質(zhì)譜圖 12 第 3 章 結(jié)論 實驗結(jié)論 植物螯合肽在花生里存在 ，而且主要以 PC4 的形式存在；植物螯合肽可以螯合多種重金屬離子，在花生中，對金屬鎘的螯合能力最強； 關(guān)與測定方法，目前 有： 液相色譜法，分光光度比色法，凝膠過濾法，毛細(xì)管電泳法比較被認(rèn)可，而液相色譜法測定方法應(yīng)用最廣，選用 mBBr 柱前衍生與高效液相色譜測定 PC 則更簡單，重現(xiàn)性更好，靈敏度更高 ， 也具有較好的分離能力 。前期實驗已經(jīng)證明豆科植物及花生中植物螯合肽的存在， 而且 螯合肽的種類主要以 PC4 的形式存在， 螯合肽 PC 的生成受哪些基因調(diào)控，或者細(xì)胞所處周期時間不同會不會影響 PC 的種類，有待我們進(jìn)一步驗證。 ll wait in the line for one hour to get a ticket, and another two hours at the site, to only see a tiny bit of the place due to the crowds. Last year, 428 million tourists traveled in China over the weeklong holiday in October. Traveling during this period is a matter that needs t