【正文】 義初級(jí)階段 ‖這種奢侈品平時(shí)流流口水就算了，偏偏最近 Invitrogen公司推出了新的優(yōu)惠活動(dòng)， 買 3 盒 NuPAGE 預(yù)制膠就送電泳儀或者電轉(zhuǎn)移 ，面對(duì)這種誘惑，你難道就沒有一點(diǎn)非份之想的沖動(dòng)？ 上樣電泳 ：上樣前蛋白樣品最好離心，上樣量不宜過多，以免看結(jié)果時(shí)，每個(gè)條帶都彎彎地 ―笑 ‖你貪多嚼不爛哦。當(dāng)預(yù)染的 Marker 告訴你，你要分辨的蛋白已經(jīng)到達(dá)最佳分辨區(qū) ——分離膠的 2/3 處， OK，電泳結(jié)束了?？捡R斯亮藍(lán)使用簡(jiǎn)便快速，可以分辨 1ug左右的條帶，是最經(jīng)濟(jì)通用的蛋白 PAGE 膠電泳染色方法?？墒怯捎诳捡R斯亮藍(lán)染色或者銀染經(jīng)過固定不可逆結(jié)合，會(huì)干擾后面的 Western Blot 實(shí)驗(yàn)，很多人會(huì)選擇省略掉這一步——同樣的樣品跑 2 塊膠，一塊染色一塊轉(zhuǎn)膜，一般也可以說明問題?？上?SYPRO Tangerine 價(jià)格挺貴的， 500ul（ 5000x）要 2020 元，即使很節(jié)約的用只夠大概 100 多次呢。麗春紅的檢測(cè)靈敏度和考馬斯亮藍(lán)差不多。在轉(zhuǎn)移膜上顯色其實(shí)就像是畫家在畫布上作畫一樣，不光要有好的畫筆和顏料，適合的畫布也是相當(dāng)之重要。因此，選擇適合的轉(zhuǎn)移膜，要讓轉(zhuǎn)移 ―膜 ‖高一尺，幫襯而不是阻礙到我們的實(shí)驗(yàn)。具體哪種膜適合于哪些實(shí)驗(yàn)?zāi)?？選擇的根據(jù)主要有： （也就是單位面積的膜能結(jié)合蛋白的載量），以及膜的孔徑（也就是攔截蛋白的大?。?； （也就是適和用于所選的顯色方法，信噪比好）； ，比如要做蛋白測(cè)序或者質(zhì)譜分析，還要根據(jù)不同目的來挑選不同的轉(zhuǎn)移膜，就像國(guó)畫要選擇宣紙，油畫要挑亞麻布或薄棉扣布一樣。 適用范圍 一般蛋白 一分子量小于 20kD 蛋白 一分子量小于 7kD 蛋白 低濃度小分子蛋白、酸性蛋白、糖蛋白和蛋白多糖 (主要用在核酸檢測(cè)中 ) 糖蛋白檢測(cè)和蛋白質(zhì)測(cè)序 價(jià)格 價(jià)格較便宜 便宜 較貴 1. 硝酸纖維素膜 硝酸纖維素膜是蛋白印跡最廣泛使用的轉(zhuǎn)移介質(zhì)，對(duì)蛋白有很強(qiáng)的結(jié)合能力，而且適用于各種顯色方法，包括同位素，化學(xué)發(fā)光（ Luminol 類）、常規(guī)顯色、染色和熒光顯色；背景 低，信噪比高。轉(zhuǎn)移到 NC 膜上的蛋白在合適的條件下可以穩(wěn)定保存很長(zhǎng)時(shí)間， Schleicher amp。不過要注意的是純的硝纖膜在比較脆，又容易卷，操作要小心，不適合用于需要多次重復(fù)清洗的用途 ——因?yàn)榻?jīng)不起 多次 ―折磨 ‖。另外還要注意選擇純的 NC 膜 ——混有含醋酸纖維（ CM）的 NC 膜結(jié)合力會(huì)有所降低。 硝纖膜最為大家熟悉和認(rèn)可的品牌就是 Schleicher amp。 Schleicher amp。前者 Protran一直是 Schleicher amp。一般而言， NC 膜越純，其蛋白結(jié)合能力就越高，所以要增加 WB 的靈敏度和分辨率，提高所使用膜的純度是個(gè)可以考慮的選擇。而Protran在制作過程中去除了各種雜質(zhì)，保證了其純度，從而增加了蛋白結(jié)合能力。但是 Protran由于是純 NC 膜，比較脆，機(jī)械耐受力欠佳，需要小心操作，如果擔(dān)心自己 ―粗手粗腳 ‖，那么就可以考慮一下 Optitran或者 Pall 公司的以耐受力著稱的 BioTrace NT Nitrocellulose Transfer Membrane。不過有的使用過的人反應(yīng)不如純 NC 膜結(jié)合能力強(qiáng)。說它有趣是因?yàn)榭紤]周到，利于高通量操作，但其實(shí)也就是將濾紙和 NC 膜紙?zhí)壮蔀V紙 —NC 膜—濾紙的層迭形式，預(yù)先切割裝訂好，方便使用。不知道為什么在國(guó)外硝纖膜會(huì)被當(dāng)作危險(xiǎn)品來運(yùn)輸還要加收運(yùn)費(fèi)，所以貨期蠻長(zhǎng)的，所以還是卷膜好，一卷用 n年 ——如果非要給這個(gè) n加個(gè)期限，那就是 ......至少可以用到等我畢業(yè)之后。 聚偏二氟乙烯（ PVDF）膜作為基質(zhì)的轉(zhuǎn)印膜由 Millipore 公司在 1985 年首先推出。市售硝酸纖維素膜的典型結(jié)合量是80100μg/cm2,而 PVDF 膜結(jié)合量是 100200μg/cm2（而結(jié)合強(qiáng)度 PVDF 比硝纖膜強(qiáng) 6 倍?。?。但是 PVDF 膜最大的優(yōu)點(diǎn)不僅于此：更好的機(jī)械強(qiáng)度和化學(xué)耐受性使 PVDF膜在各種染色應(yīng)用和多重免疫檢測(cè)中成為理想選擇；而且單個(gè)凝膠的泳道復(fù)本可用于多種目的，如考馬斯亮藍(lán)染色后切出條帶并進(jìn)行 N末端測(cè)序、蛋白消化 /肽分離 /內(nèi)部測(cè)序和免疫檢測(cè)（ Kurien,et al.,2020)。所以 PVDF 也是要做蛋白測(cè)序的唯一選擇。 PVDF 膜適用的檢測(cè)方法也 不少，化學(xué)發(fā)光、常規(guī)顯色、同位素和標(biāo)準(zhǔn)染色都一樣 OK，但不適合熒光。 PVDF 膜同樣分 ，后者孔徑小，對(duì)小分子蛋白有較好的攔截吸附，背景可能會(huì)比前者稍高。 ImmobilonP 膜孔徑均一，具有極強(qiáng)的吸附能力，染色性能好、抗溶劑能力強(qiáng)和信噪 比高，有助于提高檢測(cè)靈敏度，而且開放的孔結(jié)構(gòu)容易接近被吸附的蛋白質(zhì)，并有助于去除背景上沒有吸附的探針，可以說是免疫印跡檢測(cè)理想的印跡膜。內(nèi)表面面積較大，可供蛋白質(zhì)吸附從而提高蛋白質(zhì)測(cè)序的得率。 ImmobilonFL也是 Millipore 值得驕傲的產(chǎn)品，因?yàn)檫@是第一個(gè)專門為熒光顯色優(yōu)化的轉(zhuǎn)移膜。這幾種膜除了一般的 PVDF 膜的優(yōu)點(diǎn)之外，最大特點(diǎn)就是一個(gè)字 ——快。這可真是個(gè)好消息，因?yàn)樽谀莾旱萕B 結(jié)果多浪費(fèi)時(shí)間??！縮短這個(gè)費(fèi)時(shí)而枯燥的過程，早出結(jié)果，可以提高實(shí)驗(yàn)效率，利于我們分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，考慮下步對(duì)策嘛。再次強(qiáng)調(diào)的是，疏水 PVDF 膜在用前必須經(jīng)過 50%或以上體積比的甲醇或者乙醇溶液處理幾分鐘，待膜變成半透明后用 MilliQ 水或者純水漂洗一下，轉(zhuǎn)入電泳緩沖液平衡才能用。 3. 尼龍膜 尼龍膜更多 是用于核酸的轉(zhuǎn)移，也有見于蛋白印跡，比如 dot blot，比較于 NC膜來說，它的優(yōu)點(diǎn)是結(jié)合力強(qiáng)，特結(jié)實(shí)又柔軟且不易卷曲，機(jī)械強(qiáng)度大，便于操作，缺點(diǎn)是背景高 ——由于尼龍膜電荷密度高，使得非結(jié)合區(qū)的封閉比疏水性NC 膜困難，對(duì)于靈敏度高的檢測(cè)方法，背景問題尤為突出（據(jù)分子克隆 III 說通過熱處理的酪蛋白和 1%聚乙烯吡咯烷酮延長(zhǎng)封閉時(shí)間可以改善），而且當(dāng)轉(zhuǎn)移緩沖液中存在有 SDS 時(shí)蛋白質(zhì)就容易從尼龍膜上泄漏（通過甲醛固定可以緩解這一情況）。因此在許多情況下實(shí)驗(yàn)室人員進(jìn)行 WB 實(shí)驗(yàn) 不選擇尼龍膜。比如說，化學(xué)發(fā)光底物做得相當(dāng)出色的 Pierce 公司，其旗下的 Biodyne Aamp。這種分為 A， B 兩型的尼龍膜做工精良，孔徑大小一致，為了保有尼龍膜高靈敏度的優(yōu)點(diǎn)和摒棄背景影響大的缺點(diǎn)， Biodyne 采用了合適的signaltonoise 比例來調(diào)整，從而達(dá)到了 200ug/cm2 的蛋白結(jié)合能力，同 時(shí)有比大多數(shù)尼龍膜甚至比一些 NC 膜都要小的低背景。另外 Biodyne 相對(duì)于 NC 膜來說還是一種 ―打不怕，撕不爛，燒不著（ 200℃ 一下） ‖的 ―頑強(qiáng) ‖的轉(zhuǎn)移膜。經(jīng)典的轉(zhuǎn)膜方法是電轉(zhuǎn)移，這個(gè) 生物通 在前面的 WesternBlot 儀器之選 里面有提到過，因?yàn)殡娹D(zhuǎn)移需要配套垂直電泳槽來進(jìn)行。一些細(xì)節(jié)： 1. 記得全程手套操作，一則避免手印污染影響結(jié)果，二則保護(hù)自己（未交聯(lián)的丙烯酰胺、甲醛等等雖不立即致命但都會(huì) 慢慢毒害你的身體，可不要這樣白白為科學(xué)獻(xiàn)身哈） 2. 如果 WB 前沒有可參考的資料 ——比如不知道是否有表達(dá)，比如抗體少還要摸條件（稀釋度），可以用剪膜剩下的邊角料來先做幾組點(diǎn)雜交摸條件，省點(diǎn)時(shí)間省點(diǎn)試劑； 3. 去掉積層膠后，預(yù)染的 Marker 可用以識(shí)別膠上下方向和膜的正反面（預(yù)染 Marker 如果照著說明書用量，有可能在電泳時(shí)看不到條帶，但轉(zhuǎn)膜時(shí)有濃縮效應(yīng)而且背景白就可以看到了。膜上要做好標(biāo)記，識(shí)別正反面和上下。膜和濾紙一起裁最好（不過濾紙上下疊多了膜不好剪，硝纖膜容易裂，用利刀 +尺子 +墊厚報(bào)紙劃比較容易）盡量和膠一樣大小，膠用純水沖洗一下后用電泳緩沖液平衡過再量。 4. 對(duì)于特別小的蛋白， tricine SDSPAGE 電泳有助于提高蛋白大小在1KD—20KD 間的分辨率，不用甘氨酸，丙烯酰胺的濃度也不用太高（可參考 2020 年中國(guó)生物工程雜志上有一 篇文章（ 有效分離 1kD 小肽的TricineSDSPAGE 方法 ）， 87 年 ）。還有人在這一步浸泡幫助蛋白復(fù)性，可以直接在膠上檢測(cè)蛋白活性。最后浸沒入緩沖液里平衡。以后的步驟中不要讓膜干涸了，萬一不幸發(fā)生也用同樣處理。 8. 半干電轉(zhuǎn)移（ SemiDry）用經(jīng)過緩沖液飽和的濾紙代替?zhèn)鹘y(tǒng)轉(zhuǎn)移槽，非常節(jié)約試劑，而且效果也好。半干轉(zhuǎn)可以在 30 分鐘內(nèi)完成轉(zhuǎn)膜（每平方厘米電流—，恒流，冷庫。如果有那種溫度貼，可以貼上參考溫度），即使 205KD 這么大的蛋白轉(zhuǎn)膜效率也高達(dá) 80%。半干轉(zhuǎn)可以上下層疊 2 塊膠 +膜一起轉(zhuǎn)（面積還是按照單個(gè)計(jì)算），或者并排放（ 2 塊膠的面積計(jì)算），只要控制好單位 面積的電流強(qiáng)度和時(shí)間，防止過熱就好了。 11. 如果只做 Western Blot，膜可以用麗春紅 S 染色并在脫色前照相，對(duì)后面的免疫反應(yīng)影響不大。如果有預(yù)染 Marker 需要用針或者筆扎眼記錄條帶位置，以免后面會(huì)洗掉而無法判斷結(jié)果。如果有能在Western結(jié)果顯色的 Marker（比如 生物通 前面特別推薦的 別出心裁 特別好用的蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn) 誰可小看 ―蛋白標(biāo)準(zhǔn) ‖（下） ）就更方便了。除了要做 HPLC 分析應(yīng)該用麗春紅 S 而不要用考馬斯亮藍(lán)或者氨基黑染色，其他的比如測(cè)序和或者 PTH 都可以選靈敏度高些的考馬斯亮藍(lán)或者氨基黑。 13. 轉(zhuǎn)印后的 PVDF 膜在含 20%甲醇溶液中在白透射光照下不用染色也依稀可以看到透明的蛋白條帶，有時(shí)這種快速的方法可以不用染色識(shí)別條帶，避免染色膜影響后繼實(shí)驗(yàn)。 Western的靈敏度某種程度上受限于封閉做的好不好。如果采用堿性磷酸酶檢測(cè)系統(tǒng)，封閉劑最好用 6%酪蛋白 +1%聚乙烯吡咯烷酮+10mmol/L EDTA 磷酸緩沖鹽加熱 65 度 1 小時(shí)確保堿性磷酸酶失活（可以加 %疊氮化鈉，新鮮最好）。但是疊氮鈉 (NaN3)對(duì)辣根過氮化物酶 (HRP)有滅活作用，如果用 HRP 檢測(cè)系統(tǒng)則封閉液不要加疊氮化鈉為好。封閉時(shí)間和封閉劑的量都要足夠。 15. 如果選用 AP 作為顯色方法，封閉時(shí)就要選擇 Tris 緩沖體系，不要用 PBS，因?yàn)?PBS 干擾 AP。下一篇轉(zhuǎn)到顯色試劑的選擇了。 講完了 Western Blotting 的電泳轉(zhuǎn)移儀器，蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)和轉(zhuǎn)移膜之后，我們最后來探討一下 WB 的檢測(cè)系統(tǒng)。我個(gè)人覺得底物顯色這最后一步是最關(guān)鍵的，也是最有文章可以作的一個(gè)部分。另外如果實(shí)驗(yàn)室有已經(jīng)建立的固定的顯色方法，那也沒關(guān)系，有時(shí)候不經(jīng)意瀏覽到的方法可能就會(huì)對(duì)你的實(shí)驗(yàn)有莫大的幫助 ——這也就達(dá)到我們的目的了。如果沒有這些信息可以遵從以下原則：?jiǎn)慰箤Ｒ恍愿?，但是?jīng)過 SDSPAGE 變性膠電泳的蛋白質(zhì)可能由于原來的識(shí)別位點(diǎn)構(gòu)象發(fā)生改變而不被識(shí)別，多抗不如單抗專一性高但更容易得到結(jié)果。除了無標(biāo)記的一抗，還有生物素等各種標(biāo)記一抗。畢竟不是 WB 的主流方法。 二級(jí)試劑的作用是信號(hào)擴(kuò)增，選擇是根據(jù)一抗的標(biāo)記形式而決定的，對(duì)于無標(biāo)記的一抗，可以選擇對(duì)應(yīng)一抗來源種屬的標(biāo)記二抗，或者更便宜的標(biāo)記蛋白 A（來自金黃葡萄球菌 Protein A 可以高度親和來自人，兔，豚鼠的 IgG，但對(duì)大鼠、山羊和雞的 IgG 親和力弱）。 酶促反應(yīng)比同位素安全且快速，已經(jīng)成為 Western Blot 的主流檢測(cè)方法。最為大家熟悉當(dāng)數(shù)辣根過氧化物酶 HRP（ Horseradish Peroxidase，屬于過氧化物酶 POD 類）和堿性磷酸酶 AP（ Alkaline Phosphatase），此外還有比較少見的葡萄糖氧化酶（ Glucose Oxidase）、 β半乳 糖苷酶βGalactosidase。 HRP 的底物種類有不少，主要可以分為化學(xué)發(fā)光底物和生色底物 2 大類。 HRP 的生色底物顯色有 DAB， 4CN ， CN/DAB， AEC 和 TMB 等（而得到可溶性產(chǎn)物的底物如 OPD， ABTS 等則適用于 ELISA）中，與化學(xué)發(fā)光法中的酶促基團(tuán)發(fā)光不同，底物顯色主要是利用底物在有 HRP 和過氧化氫的存在下失去電子而呈現(xiàn)出顏色變化積累這一過程檢測(cè) WB 的結(jié)果。339。 DAB 的選擇有一點(diǎn)小小的技巧 ——339。二氨基聯(lián)苯胺 4 鹽酸鹽的純品分子量為 ，通常是深棕色粉末，不太好溶于水，容易得到有色顆粒的溶液而導(dǎo)致膜上的背景，而且價(jià)格還被炒得貴；但是如果選擇 2 水合 339。二氨基聯(lián)苯胺 4 鹽酸鹽（分子量 ）就是白色粉末狀晶體，易溶，溶液無色均勻，量大價(jià)格還便宜。由于 DAB 顯色是褐色，不如 4CN 反差大容 易拍照，有的廠家還推出了 DAB+4CN混合底物，結(jié)合了 DAB 靈敏度高和 4CN 背景低，易成像的優(yōu)點(diǎn)，能獲得很好的黑色沉淀成像。 TMB 的 signaltonoise 信噪比高，成分安全，特別合適于靈敏度要求高的 WB，但是也要避免由于靈敏度高而引起的高背景，因此可以相應(yīng)的延長(zhǎng)封閉的時(shí)間和注意洗滌的次數(shù)； ACE 各方面性質(zhì)與 DAB 相似，但靈敏度要比 DAB 差一點(diǎn)。 Luminol 是經(jīng)典的 HRP 化學(xué)發(fā)光底物?；瘜W(xué)發(fā)光法由于僅在酶和底物都存在的時(shí)候才會(huì)發(fā)光，不同于生色反應(yīng)般形成不溶的產(chǎn)物于膜上累積，所以特別適合同一張膜對(duì)不同的目標(biāo)蛋白分別進(jìn)行多次檢測(cè)。隨著 CooledCCD 技術(shù)的發(fā)展，成像系統(tǒng)成本越來越低