western-blot實(shí)驗(yàn)方法步驟-在線瀏覽
2025-07-14 00:51本頁(yè)面
【正文】 glycine 144克 加去離子水，定容至 1000ml SDS 10克 ? PH 稱取 Tris，加 60ml ddH2O溶解，調(diào) PH至 ，定容 100ml ? 稱取 Tris，加 60ml ddH2O溶解，調(diào) PH至 ，定容 100ml ? 轉(zhuǎn)膜緩沖液 稱取 ， Glycine，用 ddH2O溶解，定容至800ml，臨用前加 200ml甲醇 10*： ， 144克 Glycine，用 ddH2O溶解，定容至800ml。 配制試劑 ? 4 SDS Sample Buffer Tris HCL，溶解在 30ml水中，調(diào) 8克 SDS 定容至 100ml 40ml甘油 10ml DTT貯存液 ? 1mol/L DTT貯存液： 20℃ 保存，分裝成 1ml。并非所有的單克隆抗體都適合作為探針用于 WETERNBLOT，因?yàn)檫@一實(shí)驗(yàn)中靶蛋白是徹底變性的。因而不可能預(yù)言用特定多克隆抗血清來測(cè)定某一固定化變性靶蛋白上的不同抗原表位的效果。 實(shí)驗(yàn)步驟 ? 配膠 ? 制膠 先用 1ml槍頭小心鋪 10%分離膠，上加少許異丙醇，待分離膠干凝后，倒去異丙醇，用水洗去多余未聚合的膠，濾紙吸干。 ? 上樣，所有上樣孔均加樣，沒有樣本，用上樣緩沖液代替。 實(shí)驗(yàn)步驟 ? 轉(zhuǎn)膜 小心取下凝膠，把預(yù)先在轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡過的 Whatman濾紙及硝酸纖維素膜切成與凝膠同樣大小，按次序疊放在一起，在 4度 100V電壓轉(zhuǎn)膜 1H,取出硝酸纖維素膜，右上角切去以作標(biāo)記，麗春紅染色，可見多條粉紅色條帶，再用 TBST漂洗至膜發(fā)白。將硝酸膜浸在 20ml封閉液中，室溫?fù)u 2h后。二抗孵育 ? 二抗雜交孵育：將辣根過氧化物酶連接的二抗用含 5%脫脂奶粉的 1 TBST溶液稀釋，使?jié)舛葹?:2021，并加入辣根過氧化物酶連接的抗生物素抗體（濃度為 1:1000），將膜置于二抗稀釋液中，室溫振蕩孵育 1h；而后吸棄二抗稀釋液，用 1 TBST洗 3次，每次 5min。 疑難雜證 ? 沒有注明可以用來做 western blot的一抗，可以用來做 western blot嗎？ 不一定 ,因?yàn)橛械目贵w是識(shí)別線性表位的 ,有的是識(shí)別構(gòu)象型表位的，識(shí)別構(gòu)象型表位的抗體不能用于 western blotting，因?yàn)樵?western blotting中抗體識(shí)別的是完全變性的蛋白質(zhì)抗原，而蛋白質(zhì)抗原的構(gòu)象型表位變性時(shí)被破壞。因?yàn)槿绻Y(jié)果里面有非特異信號(hào)的話，就說不清楚了。 曾經(jīng)做過 Western在同一張膜上檢測(cè)兩種蛋白。在上一抗之前，根據(jù) Marker的條帶把膜水平剪開，分子量小的目的蛋白在下面半張，大的在上面半張。 疑難雜證 ? western blot 使用的膜哪種最好啊， PVDF好還是NC膜，能介紹一下膜的選擇嗎？ PVDF膜價(jià)格較貴，可重復(fù)使用，特別適合蛋白印跡，結(jié)合能力較強(qiáng)，但價(jià)格比較昂貴。 都可以用麗春紅染色。 疑難雜證 ? 請(qǐng)問分子量為 41KD和 57KD作 WESTERN時(shí) ,可以分開切膠嗎 ?分別用多大電流轉(zhuǎn)膜 ?轉(zhuǎn)多
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