【正文】 氧化氫（ H2O2） 2． 菌種培養(yǎng)：將測試菌種接種于合適的培養(yǎng)基斜面上，適溫培養(yǎng) 18－ 24h。也可將過氧化氫溶液直接加入斜面上，觀察氣泡的產(chǎn)生。 甲基紅（ Methyl Red）試驗 腸桿菌科各菌屬都能發(fā)酵葡萄糖，在分解葡萄糖過程中產(chǎn)生丙酮酸，進(jìn)一步分解中，由于糖代謝的途徑不同，可產(chǎn)生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產(chǎn)物，可使培養(yǎng)基 PH 值下降至 以下，使甲基紅指示劑變紅。 1176。 C（以 30176。迄至發(fā)現(xiàn)陽性 或至第 5 天仍為陰性、即可判定結(jié)果。故在 以下，隨酸度而增強(qiáng)黃色，在 以上，則隨堿度而增強(qiáng)黃色，在 或上下接近時，可能變色不夠明顯，此時應(yīng)延長培養(yǎng)時間，重復(fù)試驗。 試驗方法： １） O’Meara 氏法：將 試驗菌接種于通用培養(yǎng)基，于 36177。 C 培養(yǎng) 48h，培養(yǎng)液 1ml 加 O’Meara 試劑（加有 %肌酸 Creatine 或肌酸酐 Creatinine 的 40%氫氧化鈉水溶液） 1ml，搖動試管 1~2min，靜置于室溫或 36177。 C 恒溫箱，若4h 內(nèi)不呈現(xiàn)伊紅、即判定為陰性。 C 水浴放置 2h 后判定結(jié)果者。 1176。 Cα萘酚（ 2naphthol）純酒精溶液 ,再加 40%氫氧化鉀水溶液 ， 搖動 2~5min，陽性菌常立即呈現(xiàn)紅色，若無紅色出現(xiàn)，靜置于室溫或 36177。 C 恒溫箱，如 2h 內(nèi)仍不顯現(xiàn)紅色、可判定為陰性。不產(chǎn)酸的培養(yǎng)物不能使用。在用于芽胞桿菌和葡萄球菌等其它細(xì)菌時，通用培養(yǎng)基中的磷酸鹽可阻礙乙酰甲基醇的產(chǎn)生，故應(yīng)省去或以氯化鈉代替。測定的基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方很多，因種而異。培養(yǎng)基可制成液體，分裝試管，也可制成固體平板。糖的含量一般為 1％，醇類酚類等的含量一般為 － ％，氨基酸的含量一般為 ％。有些底物不宜用高壓滅菌，可用過濾法滅菌后加入已滅菌的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，某些醇類和酚類不必滅菌。平板培養(yǎng)用接種環(huán)點(diǎn)種，液體培養(yǎng)則用直針接種。 適溫培養(yǎng) 7 天后觀察，凡測定菌在有碳水化合物的培養(yǎng)基中生長情況，明顯超過空白培養(yǎng)基的生長量為陽性，否則為陰性。 葡萄糖的氧化發(fā)酵試 驗 在細(xì)菌鑒定中，糖類發(fā)酵產(chǎn)酸是 1 項重要依據(jù)。前者包括的菌種類型為多數(shù)。為此， Hugh 和 Leifson 提出一種含有低有機(jī)氮的培養(yǎng)基，用以鑒定細(xì)菌從糖類產(chǎn)酸是屬氧化型產(chǎn)酸或發(fā)酵型產(chǎn)酸。一般用葡萄糖作為糖類代表。 （ 1）接種 ：以 18－ 24h 的幼齡菌種，穿刺接種在上述培養(yǎng)基中，每株菌接 4 管，其中 2 管用油封蓋（凡士林：液體石蠟＝ 1： 1 混合后滅菌），約加 － 1 厘米厚，以隔絕空氣為閉管。適溫培養(yǎng) 7 天觀察結(jié)果。發(fā)酵型產(chǎn)酸則開管及閉管均產(chǎn)酸，如產(chǎn)氣，則在瓊脂柱內(nèi)產(chǎn)生氣泡?？捎弥甘緞┘鞍l(fā)酵管檢驗。接種后，置 36177。C 培養(yǎng)，每天觀察結(jié)果，檢視培養(yǎng)基顏色有無改變（產(chǎn)酸），小倒管中有無氣泡，微小氣泡亦為產(chǎn)氣陽性，若為半固體培養(yǎng)基，則檢視沿穿刺線和管壁及管底有無微小氣泡，有時還可看出接種菌有無動力，若有動力、培養(yǎng)物可呈彌散生長。一般常用的指示劑為酚紅、溴甲酚紫，溴百里藍(lán)和 Andrade 指示劑。 硝酸鹽（ Nitrate）還原試驗 有些細(xì)菌具有還原硝酸鹽的能力，可將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽、氨或氮?dú)獾取? 試驗方法：臨試前將試劑的 A（磺胺酸冰醋酸溶液）和 B（α－萘胺乙醇溶液）試液各 等量混合、取混合試劑約 、加于液體培養(yǎng)物或瓊脂斜面培養(yǎng)物表面，立即或于 10min 內(nèi)呈現(xiàn)紅色即為試驗 陽性，若無紅色出現(xiàn)則為陰性。進(jìn)行試驗時必須有未接種的培養(yǎng)基管作為陰性對照。 靛基質(zhì)（ Imdole）試驗 某些細(xì)菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚與對二甲基氨基苯醛結(jié)合，形成玫瑰吲哚，為紅色化合物。 1C 培養(yǎng) 24h時后，取約 2ml 培養(yǎng)液，加入 Kovacs 氏試劑 2~3 滴，輕搖試管，呈紅色為陽性，或先 加少量乙醚或二甲苯，搖動試管以提取和濃縮靛基質(zhì)，待其浮于培養(yǎng)液表面后，再沿試管壁徐緩加入 Kovacs 氏試劑數(shù)滴，在接觸面呈紅色，即為陽性。 1三糖鐵（ TSI）瓊脂試驗 試驗方法：以接種針挑取待試菌可疑菌落或純培養(yǎng)物，穿刺接種并涂布于斜面，置 36177。 本試驗可同時觀察乳糖和蔗糖發(fā)酵產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣（ 變黃）；產(chǎn)生硫化氫（變黑）。 1氨基酸脫羧酶的測定 有些細(xì)菌含有氨基酸脫羧酶，使羧基釋出，生成胺類和二氧化碳。當(dāng)培養(yǎng)基含胺類時呈堿性反應(yīng)，使指示劑變色。接種后封油，對照管與測定管同時接種封油。當(dāng)指 示劑呈紫色或帶紅色調(diào)的紫色者為陽性，呈黃色者為陰性。 1硫化氫（ H2S）試驗 有些細(xì)菌可分解培養(yǎng)基中含硫氨基酸或含硫化合物，而產(chǎn)生硫化氫氣體，硫化氫遇鉛鹽或低鐵鹽可生成黑色沉淀物。 1℃培養(yǎng) 24~28h，培養(yǎng)基呈黑色為陽性。也可用醋酸鉛紙條法：將待試菌接種于一般營養(yǎng)肉湯，再將醋酸鉛紙條懸掛于培養(yǎng)基上空，以不會被濺濕為適度；用管塞壓住置 36177。紙條變黑為陽性。 接種與觀察結(jié)果：取幼齡菌種接種于斜面上，適溫培養(yǎng) 3－ 7 天，培養(yǎng)基呈堿性（藍(lán)色）者為陽性反應(yīng)，不變者則為陰性。能否利用丙二酸鹽，也是細(xì)菌鑒定中的一個鑒別性特征。 接種和觀察結(jié)果： 用幼齡菌種接種測定培養(yǎng)基和空白培養(yǎng)基，于適溫培養(yǎng) 1－ 2d，觀察培養(yǎng)基變色情況。反之，如測定培養(yǎng)基未變色，而空白對照培養(yǎng)基生長，則為陰性，即不利用丙二酸鹽。葡萄糖酸無還原性基團(tuán)，氧化后形成酮基，則可將斐林氏試劑的呈藍(lán)色的銅鹽還原為磚紅色的 Cu2O 沉淀。分裝試管，每管 2mL。 1硫化氫 靛基質(zhì) 動力（ SIM）瓊脂試驗 試驗方法：以接種針挑取菌落或純養(yǎng)物穿刺接種約 1/2 深度，置 36177。培養(yǎng)物呈現(xiàn)黑色為硫化氫陽性，混濁或沿穿刺線向外生長為有動力 ，然后加 Kovacs 氏試劑數(shù)滴于培養(yǎng)表面，靜置 10min，若試劑呈紅色為靛基質(zhì)陽性。 本試驗用于腸桿菌科細(xì)菌初步生化篩選，與三糖鐵瓊脂等聯(lián)合使用可顯著提高篩選功效。 測定步驟： （ 1） 將測定菌接種于 TSI 斜面上，培養(yǎng)于 37℃ 18h（或其他最適溫度） （ 2） 挑取 1 大環(huán)菌苔入約 的生理鹽水中制成菌懸液，每管加 1 滴甲苯，搖勻（有助于酶的釋放），于 37℃放置 5 分鐘。經(jīng) 30 分、 …… 24h 進(jìn)行觀察，如有黃色者則為陽性。由于不同菌類耐鹽性不同，故常以此作為鑒別特征。 以肉湯培養(yǎng)液根據(jù)鑒定需要，配成不同濃度的 NaCl，如 2％、 ％、 5％、7％、 10％等。 卵磷脂酶的測定 菌體如存在有卵磷脂酶，就能使卵磷脂分解生成脂肪和水溶性的磷酸膽堿。假若與對照管相比較，在卵黃胰胨液中或表面，形成白色沉淀者，則為陽性反應(yīng)，表示卵磷脂被分解，生成脂肪和水溶性的磷酸膽堿，說明有卵磷酶的存在。 接種與觀察結(jié)果：將測試菌點(diǎn)接在卵黃平板上，每皿可分散點(diǎn)接 4－ 5 株菌、（芽孢桿菌以點(diǎn)接 1－ 2 株菌為宜）以不影響結(jié)果觀察為度，如測試厭氧菌，則