【正文】 的克隆及序 列分析 基因的克隆 以成熟紅肉蜜柚和琯溪蜜柚果實(shí) cDNA 為模板，以上游引物5’ATGTCTGTTACATTGCTGTGGG3’和下游引物 5’TTAAGCCTTACTGGTATAT ATTCTTG3’， PCR擴(kuò)增程序如表 14。 割膠回收 對(duì)目的條帶進(jìn)行割膠回收，回收步驟如下 ： ① 將 PCR產(chǎn)物在 1 ％瓊脂糖凝膠上電泳，切下所需 DNA條帶 ，將其 裝入 mL離心管； ② 200~400 mg瓊脂糖凝膠加入 mL純化樹脂， 70 ℃ 保溫 5~10 min，每 2 min顛倒混勻一次，使瓊脂糖凝膠完全融 化； ③ 將混合液用移液器裝入離心純化柱， 13000 rpm離心 30 s，倒掉廢液； ④ 加入 500 μL 80 ％乙醇， 13000 rpm離心 30 s，倒掉收集管中的廢液；（重復(fù)第 4步一次，此步驟 13000 rpm 離心 2 min，務(wù)必將乙醇除盡） ⑤ 將純化柱套入干凈 mL離心管中，加入 25 μL超純水于純化樹脂， 70 ℃ 水浴 2 min， 13000 rpm 離心 30 s； ⑥ 離心管中液體即是純化 DNA片段，取 3 μL電泳檢測(cè)并且測(cè)定含量。 回收產(chǎn)物與生工 pUCmT 載體進(jìn)行連接克隆。 序列測(cè)定 鑒定 后的 克隆 送至 上海英俊生物技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果提交到 NCBI 中核 酸數(shù)據(jù)庫(kù)做 BLAST 同源性檢索，并利用 Clustal X 軟件對(duì)所得序列進(jìn)行 分析。 正文： 紅肉蜜柚及其親本琯溪蜜柚 PSY 基因的分離 9 采用改良 Bugos 法提取紅肉蜜柚突變體及其親本琯溪蜜柚果實(shí)總 RNA，色澤白，較為透明，易于溶解。 圖 11 果肉 RNA 瓊脂糖凝膠電泳圖譜 注： 1. 紅肉蜜柚； 2. 琯溪 蜜柚 RNA 紫外分光光度計(jì)測(cè)定結(jié)果分析 一般情況下，紫外測(cè)定結(jié)果 OD260/OD280比值為 ， OD260/OD230比值大于 時(shí)認(rèn)為獲得的 RNA 樣品較純凈。從表 15 測(cè)定結(jié)果可以看出， OD260/OD230的吸光度比值大于 ，說(shuō)明沒(méi)有多糖、鹽或其他雜質(zhì)的重大污染。 純化后的 RNA 電泳結(jié)果分析 采用改良 Bugos 法提取所得 RNA 存在一定的 DNA 污染，因而應(yīng)用這些樣品進(jìn)行 RTPCR 或其它操作前應(yīng)先用 Dnase 去除 DNA，或?qū)Ρ痉椒ㄋ?RNA 進(jìn)行再次 LiCl 沉淀以進(jìn)一步去除 DNA。 1 2 1 2 正文： 紅肉蜜柚及其親本琯溪蜜柚 PSY 基因的分離 10 圖 12 果肉 RNA 純化后的電泳圖譜 注： 1. 紅肉蜜柚； 2. 琯溪蜜柚 合成的 cDNA 電泳結(jié)果分析 從圖 13 來(lái)看，合成的 cDNA 二鏈呈彌散狀， 在 500~750 bp 間有特征帶的出現(xiàn)，表明該物種果實(shí)中大部分基因的長(zhǎng)度都在該區(qū)間內(nèi)。 序列性分析 將測(cè)序結(jié)果整理如下（方框內(nèi)為 PCR 擴(kuò)增 時(shí) 所使用引物），測(cè)序結(jié)果表明，紅肉蜜柚和琯溪蜜柚 PSYcDNA 均長(zhǎng) 1317 bp， 與 NCBI 網(wǎng)站上其他相似序列比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該 DNA 序列 包含完整的閱讀框，編碼 423 個(gè)氨基酸。 表 16 紅肉蜜柚果實(shí) PSY 基因測(cè)序結(jié)果比對(duì) Accession Description Max score Total score Query coverage Maxident gi|166343817| Citrus maxima phytoene synthase mRNA, plete cds 2448 2448 100% 99% gi|82394886| Citrus sinensis phytoene synthase mRNA, plete cds 2402 2402 100% 98% gi|6959859| Citrus unshiu phytoene synthase (Psy1) mRNA, plete cds 2402 2402 100% 98% gi|11344506| Citrus unshiu mRNA for phytoene synthase, plete cds 2402 2402 100% 98% 續(xù)表 16 gi|166343815| X Citrofortunella mitis phytoene synthase mRNA, plete cds 2390 2390 100% 98% gi|13542331| Citrus x paradisi phytoene synthase mRNA, plete cds 2384 2384 100% 98% 注： Citrus maxima：文旦； Citrus sinensis：甜橙； Citrus unshiu：溫州蜜柑； Citrofortunella mitis：正文： 紅肉蜜柚及其親本琯溪蜜柚 PSY 基因的分離 12 四季橘； Citrus paradisi：葡萄柚 通過(guò)比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)： ① 紅肉蜜柚果實(shí) PSY 基因與柑桔屬 PSY 基因同源性都相對(duì)較高，其中與柚 PSY 基因（ No. 166343817） 同源性最高； ② 與柚 PSY 基因（ No. 166343817）比對(duì)發(fā)現(xiàn)：有一個(gè) TAA 的 gap 存在； 9 個(gè)堿基不匹配。 表 17 琯溪蜜柚果實(shí) PSY 基因測(cè)序結(jié)果比對(duì) Accession Description Max score Total score Query coverage Maxident gi|166343817| Citrus maxima phytoene synthase mRNA, plete cds 2442 2442 100% 98% 正文： 紅肉蜜柚及其親本琯溪蜜柚 PSY 基因的分離 13 gi|82394886| Citrus sinensis phytoene synthase mRNA, plete cds 2396 2396 100% 98% gi|6959859| Citrus unshiu phytoene synthase (Psy1) mRNA, plete cds 2396 2396 100% 98% gi|11344506| Citrus unshiu mRNA for phytoene synthase, plete cds 2396 2396 100% 98% gi|166343815| X Citrofortunella mitis phytoene synthase mRNA, plete cds 2384 2384 100% 98% gi|13542331| Citrus x paradisi phytoene synthase mRNA, plete cds 2379 2379 100% 98% 注： Citrus maxima：文旦； Citrus sinensis：甜橙； Citrus unshiu：溫州蜜柑； Citrofortunella mitis：四季橘； Citrus paradisi：葡萄柚 通過(guò)比對(duì)可發(fā)現(xiàn) ： ① 與柑桔屬 PSY 基因同源性都較高，其中與柚 PSY 基因（ No. 166343817） 同源性最高 ； ② 與柚 PSY 基因（ No. 166343817）比對(duì)發(fā)現(xiàn) ： 有一個(gè)TAA 的 gap 存在； 8 個(gè)堿基不匹配。所有的光 合 生物以及許多非光合細(xì)菌和真菌均可以在體內(nèi)合成類胡蘿卜素。除此之外，類胡蘿卜素中一些代謝中間產(chǎn)物還具有較高的營(yíng)養(yǎng)和保健價(jià)值，如番茄紅素能預(yù)防心臟病和多種癌癥、減緩動(dòng)脈粥樣硬化、保護(hù)心血管、抗老化、保護(hù)皮膚等； ?胡蘿卜素是維生素 A 原，維生素 A 缺乏會(huì)引起夜盲癥等多種疾病的發(fā)生。應(yīng)用類胡蘿卜素合成途徑中相關(guān)基因的轉(zhuǎn)基因研究也取得了較大進(jìn)展， “ 黃金稻米 ” 就是最成功的例子 [17]。由此可見(jiàn)，為減少類胡蘿卜素遺傳工程中的盲目性，闡明植物體內(nèi)類胡蘿卜素代謝相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制十分必要。研究還表明下有途徑的調(diào)控通常只能影響類胡蘿卜素組成而對(duì)總含量影響較小。類胡蘿卜素上游合成途徑需要十種酶參與，其活性的高低直接決定了果實(shí)類胡蘿卜素的含量。本研究 根據(jù) GenBank 中報(bào)道的植物類胡蘿卜素代謝相關(guān)酶基因序列，分離了紅肉蜜柚及其親本 琯溪蜜柚果實(shí)PSY 基因 (八氫番茄紅素合成酶基因 )。八氫番茄紅素 合成類胡蘿卜素的重要前體， 類胡蘿卜素是維生素 A 重要的前體之一。在 PSY 催化下，八氫番茄紅素進(jìn) 一步脫氫生成番茄紅素。目前國(guó)外有研究將 PSY 基因轉(zhuǎn)入到水稻中，在其胚乳組織中表達(dá)并合成了類胡蘿卜素，而且比較了不同的物種來(lái)源的八氫番茄紅素合成酶基因?qū)λ九呷榻M織中合成的類胡蘿卜素含量 [17]。因此，構(gòu)建相應(yīng)的八氫番茄紅素 合成酶基因真核表達(dá)載體，并引入到其他蔬菜水果食用組織特異性啟動(dòng)子，為其合成酶基因提供物質(zhì)基礎(chǔ)，提高其食用部分的八氫番茄紅素的表達(dá)水平，為在真核生物鐘合成類胡蘿卜素奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。與野生型相比，突變體果實(shí)表型變化非常明顯， 含豐富的番茄紅素和 ?胡蘿卜素。紅肉蜜柚和琯溪蜜柚 相比，果肉部分大量積累番茄紅素和 ?胡蘿卜素。 由于 mRNA 分子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，容易受 RNA 酶的攻擊反應(yīng)而降解，加上 RNA酶極為穩(wěn)定（能耐高溫、耐酸、耐堿，高壓滅菌處理也不能使其完全失活）且廣泛存在，因而在提取過(guò)程中要嚴(yán)格防止 RNA 酶的污染，并設(shè)法抑制其活性，這是本實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。所用的玻璃 器皿需置于干燥烘箱中 180 ℃ 烘烤 2 h 以上。 DEPC 是強(qiáng) RNase 抑制劑，它和 RNA 酶的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)反應(yīng)而抑制酶活性。 DEPC 能與胺和巰基反應(yīng) ， 因而含 Tris 的試劑不能用 DEPC 處理。配制的溶液如不能高壓滅菌，可用 DEPC 處理水配制，并盡可能用未曾開封的試劑。實(shí)驗(yàn)中使用的槍頭、 EP 管、溶液都要利用 %的 DEPC 處理，耐高溫的玻璃器皿等要在 65 ℃烘烤 4 h 以上。 RNA 的提取的大體步驟：破壞細(xì)胞膜 —除去蛋白 —除去 DNA—除去鹽離子。但是高等植物，尤其是木本植物組織內(nèi)含有較多的多糖和酚類物質(zhì)，使用上述方法很難去除。即使加熱溶解，酚類和多糖的干擾也抑制了后續(xù)的反轉(zhuǎn)錄以及 PCR 反應(yīng) [13]。 本研究提取 果肉 總 RNA 所 采用的方法 是改良 Bugos 法。改良 Bugos 法可提取柑橘多種組織及成熟果實(shí)果肉中的 RNA，且所得 RNA 質(zhì)量較高，成為柑橘組織 RNA 提取方法的首選 [11]。提取高質(zhì)量、高產(chǎn)量的 RNA 是 RTPCR 的必要前提。因此，分離制備 RNA 時(shí)，首先遇到的是必須使 RNA 與蛋白解離，并除去蛋白質(zhì)。對(duì)紅肉蜜柚突變體和琯溪蜜柚果實(shí) PSY 基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)：紅肉蜜柚突變體和琯溪蜜柚與柑桔屬 PSY 基因同源性都相對(duì)較高，與柑桔屬 PSY 基因同源性都較高；兩者 PSY 序列進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)有 11 個(gè)堿基存在差異；紅肉蜜柚突變體及其野生型琯溪蜜柚果實(shí) PSY 基因氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，也有 7 個(gè)氨基酸的差異，表明紅肉蜜柚突變體的 PSY 基因只是出現(xiàn)錯(cuò)配，沒(méi)有出現(xiàn)丟 失和移碼等突變。 參考文獻(xiàn) [1] 張敏 , 鄧秀新 . 柑橘芽變選種以及芽變性狀形成機(jī)理研究進(jìn)展 [J]. 果樹學(xué)報(bào) , 2020, 23(3):871~876. 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