雜交棉與親本的基因差異表達(dá)_畢業(yè)論-在線瀏覽
2024-07-30 19:32本頁面
【正文】 h，晚上 8h， 作物產(chǎn)量形成的物質(zhì)基礎(chǔ)是光合物質(zhì)的生產(chǎn)，葉片是進(jìn)行光合物質(zhì)生產(chǎn)的主要器官，因 此當(dāng)幼苗長至兩葉一心時(shí)，本研究就剪取新陸早 43號(hào)及其親本葉片作為實(shí)驗(yàn)材料，于液氮中速凍， 70℃冰箱保存?zhèn)溆谩? 中親優(yōu)勢(shì) =（ F1雙親平均） /雙親平均 X100% 超親優(yōu)勢(shì) =（ F1HP） /HPX100% HP：高值親本 總 RNA 的提取和純化 總 RNA 的提取 運(yùn)用改良的 CTAB 法 [9]： （ 1）取 1g 棉花幼嫩葉片（三片真葉期）于研缽中，加液氮充分研磨成粉末狀，轉(zhuǎn)移到 10mL 離心管中； （ 2）往離心管中加入 5mL 的 RNA 提取緩沖液 [ NaCl， M Tris?HCl（ pH＝）， 20mM EDTA， 2%CTAB， 2%PVP， 1%β 巰基乙醇 ]，振蕩混勻， 65℃水浴約 20min，中途混和 23 次； （ 3）加入 體積的氯仿，來回充分混勻，然后冰浴 10min； （ 4） 4℃， 8000rpm 離心 20min，將上清液轉(zhuǎn)移到另一新 10mL 離心管中； （ 5）上清液中加入 1/3 倍體積的 8 M LiCl 溶液，混和均勻， 20℃放置 12h； （ 6） 4℃， 8000rpm 離心 20min，棄去 上部溶液，沉淀用 70%乙醇洗滌，并轉(zhuǎn)移到一個(gè) 2 mL 離心管中； （ 7） 4000rpm 離心 5min，吸去乙醇溶液，用真空泵將沉淀抽干； （ 8）加 2mL 的 H2ODEPC 溶解沉淀，并將溶液平均分裝入兩個(gè) 2mL 離心管中； （ 9）每管中加 倍體積的酸酚 /氯仿溶液（ 1∶ 1），充分混和均勻，然后室溫靜置 5min； （ 10） 4℃， 12021rpm 離心 20min，將上清液轉(zhuǎn)移到另一新的 2mL 離心管中； （ 11）上清液加 倍體積氯仿抽提一次； （ 12）上清液中加入 1/3 倍體積的 8M LiCl 溶液，混和均勻， 20℃放 置 12h； （ 13） 4℃， 12021rpm 離心 20min，收集 RNA 沉淀； （ 14） RNA 沉淀用 70%乙醇洗滌兩次，真空干燥后再加入 100μ L 的 DEPC H2O，使之充分溶解，取 1μ L 用瓊脂糖電泳檢測(cè) RNA 質(zhì)量，其余 RNA 于 70℃下保存。研缽等物品則經(jīng)過 240℃高溫烘烤 8h 左右。將上清移至一個(gè)干凈的微量離心管中，加入氯仿，振蕩， 4℃靜置片刻， 12021rpm， 15min。 70℃放置 30min2h 以沉淀 RNA， 12021rpm， 15min，棄上清。用 35μ L DEPC H2O 溶解沉淀，用 BACKMAN DU640 核酸 蛋白分析儀測(cè)定 OD260、 OD280 吸光度，定量 RNA 的濃度與純度， %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) RNA 質(zhì)量。本研究選擇一對(duì)在棉花各組織 cDNA 中都可擴(kuò)增出500bp 產(chǎn) 物 的 棉 花 組 成 型 表 達(dá) 基 因 EF1 α 的 引 物 (F: 5’AGACCACCAAGTACTACTGCAC3’， 5’CCACCAATCTTGTACACATCC3’) 對(duì)合成的雙鏈 cDNA 進(jìn)行 RTPCR 檢測(cè)。其中識(shí)別 6個(gè)堿基的為稀有切點(diǎn)酶 ( rare cutter ) , 識(shí)別 4 個(gè)堿基的為常見切點(diǎn)酶 ( frequent cutter ) , 要達(dá)到的理想效果是 ,前者對(duì)于系統(tǒng)中每一種 cDNA 應(yīng)該只切 1 次 , 而后者在前者切點(diǎn)的臨近位置進(jìn)行切割 , 使產(chǎn)生 100 bp 至 1000bp 長度的片段 , 以便被測(cè)序膠可以有效地分辨。預(yù)擴(kuò)增過程可為后來進(jìn)一步的選擇性擴(kuò)增提供了大量的次級(jí)擴(kuò)增模板 , 這也是cDNA AFLP 只需要很少量的起始材料 ( 大約為 100 ～ 200 mg ) 即可進(jìn)行的原因。 接頭與擴(kuò)增引物 接頭與引物 序列 EcoRⅠ （ E） 5， 3， MseⅠ （ M） 5， 3， 接頭 GTCGTAGACTGCGTACCAATTGGTACGCAGTC GACGATGAGTCCTGAGTACTCAGGACTCAT 預(yù)擴(kuò)增引物 GACTGCGTACCAATTCA(E0) GATGAGTCCTGAGTAA(M0) 選擇性擴(kuò)增引物 GACTGCGTACCAATTCACA(E1) GATGAGTCCTGAGTAAAC(M1) GACTGCGTACCAATTCAAC(E2) GATGAGTCCTGAGTAAAG(M2) GACTGCGTACCAATTCAAG(E3) GATGAGTCCTGAGTAACA(M3) GACTGCGTACCAATTCACT(E4) GATGAGTCCTGAGTAACT(M4) GACTGCGTACCAATTCACG(E5) GATGAGTCCTGAGTAATC(M5) GACTGCGTACCAATTCACC(E6) GATGAGTCCTGAGTAATG(M6) GACTGCGTACCAATTCAGC(E7) GATGAGTCCTGAGTAATA(M7) GACTGCGTACCAATTCAGA(E8) GATGAGTCCTGAGTAAGA(M8) 2．結(jié)果與分析 棉花苗期干重分析 石河子大學(xué)本科畢業(yè)論文 魏凱 雜交棉與親本的
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