【正文】 ndⅡ GTCGAC CAGCTG GAC CTG + 平端切口 黏端切口 （ sticky end） （ blunt end） Ⅱ 型限制性內(nèi)切酶具有一些共性和特性： LOGO 粘性末端又可分為兩種： 1） 5?端突出 2） 3?端突出 ………CTGCA OH G……… ………G HOACGTC……… 5? 3? 5? 3? 5? 5? PstI ………CTGCA G……… …… C ACGTC……… 5? 5? 3? 3? ………G OH AATTC……. ………CTTAA HOG…… 5? 3? 5? 5? 5? 3? EcoRI ………GAATTC……… …… CTTAAG……… 5? 3? 5? 3? LOGO 4. 不同的酶可以產(chǎn)生同樣的末端 同尾酶 （ isocaudarner）： 有些限制性內(nèi)切酶雖然識別序列不完全相同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同的黏端，這樣的酶彼此互稱為同尾酶。 Bam HⅠ Bg lⅡ GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGA G CCTAG GATCC G + + A TCTAG GATCT A互連后？ Ⅱ 型限制性內(nèi)切酶具有一些共性和特性： LOGO 5. 不同的酶可以識別同一個序列 同工異源酶（ isoschizomer）或同裂酶 能識別同一序列（切割位點可同或不同）但來源不同的兩種酶。 ? 緩沖液或環(huán)境溫度也會影響一些酶的特異性。 Ⅱ 型限制性內(nèi)切酶具有一些共性和特性： LOGO M 6. 切割會受其他因素的影響 4. 不同的酶可以產(chǎn)生同樣的末端 3. 切割雙鏈 DNA分子后產(chǎn)生黏端或平端 2. 識別的核苷酸序列通常為回文結構（ palindrome） 1. 具有特定的識別和切割位點 Ⅱ 型限制性內(nèi)切酶具有一些共性和特性： 在 DNA雙鏈內(nèi)部的特異位點識別并切割 DNA LOGO 文庫法： 一個細胞只接受一個重組 DNA分子 一般一個載體只攜帶一段外源 DNA 單克隆 LOGO 基因組 DNA文庫（ genomic DNA library）： 包含某一個生物細胞或組織全部基因組 DNA序列的隨機克隆群體，以 DNA片段的形式貯存了所有的基因組 DNA信息。 LOGO 轉膜、 變性、 封閉、 加入變性的探針、 雜交、 洗滌、 檢測雜交體。 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ First cycle ATG TAA 3’ 3’ Target sequence 下游引物、 3’ 引物、antisense primer 上游引物、 5’ 引物、 Sense primer ? 引物設計的 總原則 ——提高引物與模板結合的特異性 。 LOGO PCR引物設計的基本原則： 。 PCR。 ⑵ 堿基分布： ⑶ 引物方向： 5?→ 3? ⑷ 引物的 3?端 ：是 DNA延伸的起點 ， 一定要嚴格與模板DNA配對 。 ⑹ 同源性比較 ：引物與非特異擴增序列的同源性不要超過 70%或有連續(xù) 8個互補堿基同源 。 GC比在 4555%。 Tm=4(G+C)+2(A+T)。 3’引物與擴增片段 3’端的一小段 DNA序列互補。 5’ 3’ 3’ 5’ LOGO Sense primer: 5’－ CGCAGCGGATCC ATG AAATATACAAGT－ 3’ 15 bp GC=12 AT=15 AntiSense primer: 5’－ ATCGGAATTC TTA CTGGGATGCTCTTC－ 3’ 17 bp BamHI start codon GC=12 AT=15 EcoRI stop codon 引物的方向是 5?→3 ?： at gaaatataca agt gaagagca tcccagtaa atgaaatatacaagt 3’ 5’ 3’ 5’ 上游引物結合 cttctcgtagggtcatt 下游引物結合 5’ 3’ 3’ 5’ LOGO 瓊脂糖凝膠電泳 Agarose gel Electrophoresis PCR產(chǎn)物中 只含有 目的 DNA片段嗎？ M LOGO 二、 載體的選擇與準備（擇）； 載體（ vector）：攜帶外源 DNA，實現(xiàn)外源 DNA在受體細胞中的無性繁殖或表達有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些 DNA分子。 （二）考慮目的 DNA的 大小 及受體細胞的種類和來源 載體 插入 DNA片段 宿主細胞 質(zhì)粒 5~10 kb 細菌，酵母 λ 噬菌體載體 ~ 20 kb 細菌 黏粒 ~50 kb 細菌 BAC ~400 kb 細菌 YAC ~3Mb 酵母 （三）含有合適的 MCS LOGO 克隆載體用于外源 DNA的克隆和無性繁殖 （一）克隆載體（ cloning vector） 應具備的主要特點 復制起點 （ origin of replication, ori） 選擇性標志 （ selection marker） ： 多克隆位點 （ multiple cloning sites， MCS） pBR322質(zhì)粒圖譜 LOGO 克隆載體用于外源 DNA的克隆和無性繁殖 （二）常用克隆載體的種類 (plasmid)是最常用的克隆載體 ?廣泛存在于細菌、酵母等多種微生物中 ?獨立于宿主細胞染色體外的環(huán)狀雙鏈的超螺旋結構 ?能在宿主細胞內(nèi) 獨立自主復制 ?帶有某些遺傳信息 , 會賦予宿主細胞一些 遺傳性狀 ?質(zhì)粒的不相容性 ：兩個質(zhì)粒在同一宿主中不能共存的現(xiàn)象。 pUC18/19質(zhì)粒圖譜 pUC18/19質(zhì)粒 ， 2686bp，是最常用的質(zhì)粒載體 缺乏控制拷貝數(shù)的 rop基因，因此其拷貝數(shù)達 500700 LOGO T載體： pMD18T 2692bp HindIII Spln PstI HincII AccI SalI Xbal BamHI SmaI XmaI KpnI SacI EcoRI Sp6 T7 T T LOGO 克隆載體用于外源 DNA的克隆和無性繁殖 （二）常用克隆載體的種類 (phage) 能感染細菌的病毒 （ 1） λ 噬菌體 DNA改造系統(tǒng) cos位點 :兩端各有一條由 12個堿基組成、彼此完全互補且 5’突出的序列 插入型： λ gt系列，適用于 cDNA克隆 置換型： EMBL系列，適用于基因組 DNA克隆 線性雙鏈 DNA分子 cos cos 12bp 12bp 48500bp Nonessential portion for replication Long (left) arm Short (right) arm （ 2） M13噬菌體 DNA改造系統(tǒng)（含 lacZ基因） 單鏈閉合環(huán)狀 DNA分子 LOGO 克隆載體用于外源 DNA的克隆和無性繁殖 （二）常用克隆載體的種類 (shuttle vector) 可在不同宿主細胞中應用 人工構建，含有不止一個復制起點，能攜帶外源 DNA序列在不同種類宿主細胞中復制、擴增。 這類載體不僅具有細菌質(zhì)粒的復制原點及選擇標記基因；還有真核生物的自主復制序列及選擇標記性狀；具有多克隆位點。 LOGO 表達 載體用于外源 DNA的 表達 表達載體（ expression vector）：用來在宿主細胞中 表達外源基因 的載體 依據(jù)其宿主細胞的不同可分為 : 原核 表達載體（ prokaryotic expression vector） 真核 表達載體（ eukaryotic expression vector） LOGO 三、目的 DNA與載體連接（接） T4DNA ligase LOGO Ligation EcoRI EcoRI RE digestion Vector EcoRI Vector RE digestion Rebinant vector Rebinant vector Rebinant vector EcoRI EcoRI EcoRI EcoRI EcoRI ① 單酶消化的粘性末端連接 ： 連接效率高 。 雙向連入載體 LOGO Vector SmaI HeaIII SmaI RE digestion RE digestion Vector Ligation Helf of smaI Rebinant vector SmaI Helf of HeaIII Rebinant vector SamI Helf of smaI Helf of HeaIII ② 平頭末端連接 ： 連接效率低 雙向連入載體 自身環(huán)化率高 LOGO Target gene EcoRI BamHI EcoRI BamHI Vector Vector digestion digestion Ligation Vector EcoRI BamHI ③ 雙酶消化的粘性末端連接： 連接效率高 。 539。 539。 1. 利用 抗生素抗性標志 可篩選出帶有載體的重組子 尚需進一步鑒定載體是否為含有目的 DNA的重組載體 LOGO IPTG Bluewhite screening of rebinants 誘導物 β半乳糖苷酶 Lac Operon ? ——在指示培養(yǎng)基上用顏色直接篩選重組克隆的方法 五、重組體的篩選與鑒定（篩） 2. 藍白篩選 LOGO Blu