第二章基因工程制藥新版4-展示頁
2024-11-19 22:08本頁面
【正文】 的構型與轉化率有一定的關系，環(huán)狀DNA的轉化率要比線性DNA高出10100倍， （4）外源基因與宿主DNA和同源性越高，其轉化率也越高。,[5]轉化程序,大腸桿菌E . coli培養(yǎng)至對數(shù)生長期 ↓ 取20ml，懸浮于0.1M CaCl2 ↓ 離心，收集沉淀的原生質球。 制備人工感受態(tài)細胞的方法： （1）將對數(shù)生長期細胞于低溫、低滲的CaCl2溶液中處理，就可成為感受態(tài)細胞。,（4）人工感受態(tài)細胞,在基因工程中，宿主細胞經(jīng)過人工處理，最后成為感受態(tài)細胞，稱為人工感受態(tài)細胞。 （3）轉化作用的先決條件是要獲得攜帶目的基因的重組DNA分子。,主要基因工程表達體系比較,（二）具體的轉移技術,轉化作用 轉導作用,轉化作用,（1）基本概念 （2）轉化作用的特性 （3）感受態(tài)細胞 （4）人工感受態(tài)細胞 （5）轉化程序 （6）影響轉化的因素,（1）基本概念,轉化 (transformation)： 以質粒為載體構建的重組DNA分子導入原核細胞的過程.,（2）轉化作用的特性,（1）是自然界經(jīng)常發(fā)生的現(xiàn)象之一。 缺點： （1）生產慢、 （2）生產率低、 （3）培養(yǎng)條件苛刻、費用高， （4）培養(yǎng)液濃度較稀。 優(yōu)點： （1）有很強的蛋白質分泌能力， （2）能正確地進行翻譯后的加工，如進行糖基化、肽剪切。 雖然酵母表達系統(tǒng)表達的蛋白質有糖基化修飾，但是糖鏈結構和組成與天然糖蛋白相差甚遠，對于那些糖鏈極大影響生物活性的蛋白質，如EPO、治療性抗體等，仍不能用酵母表達系統(tǒng)表達。 優(yōu)點： （1）是研究基因表達調控最有效的單細胞真核生物， （2）其基因組小、繁殖迅速、可以利用廉價材料進行大規(guī)模培養(yǎng)， （3）無毒性， （4）基因工程操作簡單， （5）表達的蛋白質產物能夠直接分泌出細胞外， （6）能夠對蛋白質產物進行糖基化， （7）真核基因在酵母中表達良好。,（4）酵母菌,釀酒酵母研究最為透徹。 （2）枯草芽孢桿菌具有很強的胞外蛋白酶分泌系統(tǒng)，常常對蛋白質產物造成破壞。 （2）不會形成包含體。,至2004年，F(xiàn)DA共批準了大腸桿菌表達的基因重組生物技術藥物18種： 重組人甲狀旁腺激素、胰島素、生物激素、白介素、干擾素等主要為細胞因子類藥物。 （5）大腸桿菌內的蛋白酶會對目的蛋白造成破壞。 （3）所表達的真核蛋白質在其體內常形成包含體，在提取后必須經(jīng)過變性、復性處理才能恢復生物活性。 （2）細胞破碎時，細胞質內的其它蛋白質也會釋放出 來，形成雜質。 （3）基因工程研究中采用最多的表達體系。 （1）大腸桿菌 （2）枯草芽孢桿菌 （3）鏈霉菌 （4）酵母菌 （5）絲狀真菌 （6）動物細胞,（1）大腸桿菌,優(yōu)點： （1）生長迅速、大規(guī)模發(fā)酵經(jīng)濟。,宿主細胞的類型,原核細胞類：大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鏈霉菌。 （11）產物的產量穩(wěn)定、產率高。 （9）容易進行代謝調控。 （7）具有一定的細胞形態(tài)。 （5）發(fā)熱量低。 （3）不致病。 （一）宿主細胞的選擇 （二）具體的轉移技術 （三）大腸桿菌中的基因導入和表達 （四）酵母菌中的基因導入和表達 （五）動物細胞中的基因導入和表達,（一）宿主細胞的選擇,宿主細胞應滿足的條件 宿主細胞的類型,宿主細胞應滿足的條件,（1）容易獲得較高濃度的細胞。第三節(jié) 基因工程制藥生產的基本過程,一、工具酶的分離純化 二、載體的分離純化 三、外源DNA和目的基因的分離和獲得 四、外源DNA與載體DNA的切割與連接 五、宿主細胞的選擇和基因導入操作 六、基因工程菌的穩(wěn)定性及生長代謝的特點 七、基因工程菌中試 八、基因工程菌的擴增和發(fā)酵生產 九、基因工程藥物的分離和純化技術 十、變性蛋白的復性 十一、基因工程藥物的質量控制 十二、基因工程藥物的制造實例,五、宿主細胞的選擇和基因導入操作,體外重組的DNA分子，如果不引入到宿主細胞，則無法顯示其生命力，而只是表現(xiàn)出純粹的試劑性質。隨著時間的推移而逐漸失活。 （2）能夠利用廉價原料進行生產。 （4）不產生內毒素。 （6）需氧低。 （8）需有適當?shù)陌l(fā)酵濃度。 （10）容易進行DNA重組技術操作。 （12）產物容易提取和純化。 真核細胞類：酵母菌、絲狀真菌、動物細胞、昆蟲細 胞和植物細胞。 （2）分子遺傳結構清楚、操作簡單。,缺點： （1）表達產物多為胞內物質，提取時需破碎細胞。給提取帶來困難。 （4）大腸桿菌中不存在翻譯后修飾系統(tǒng)，不能對蛋白產物進行糖基化及磷酸化等修飾。 （6）大腸桿菌會產生內毒素，難去除。,（2）枯草芽孢桿菌,優(yōu)點： （1）分泌能力很強，可以將蛋白質產物直接分泌到培養(yǎng)液中。 缺點： （1）不能使蛋白質產物糖基化。,（3）鏈霉菌,優(yōu)點： （1）不致病， （2）使用安全， （3）分泌能力強， （4）可將培養(yǎng)產物直接分泌到培養(yǎng)液中， （5）具有糖基化能力 近年來，作為外源基因表達體系，正日益受到人們的重視。干擾素和乙肝表面抗原基因在酵母菌中進行克隆和表達。,至2004年，F(xiàn)DA共批準了酵母表達的基因重組生物技術藥物8種： 胰高血糖素、巨細胞集落刺激因子、乙肝疫苗、胰島素（Novolin）、水蛭素等。,（5）絲狀真菌,曲霉被認為一種安全菌株、并且已經(jīng)對它形成了成熟的發(fā)酵和后處理工藝。,（6）動物細胞,優(yōu)點： （1）表達產物可以分泌到培養(yǎng)液中， （2）培養(yǎng)
公司管理相關推薦
鄂ICP備17016276號-1