【正文】 嚴(yán)謹(jǐn)型”質(zhì)粒在每個細胞中的拷貝數(shù)通常 1~3個，而“松弛型” 通常在 10個以上，可高達 200個拷貝。 ?一般質(zhì)粒都含有一個復(fù)制起始區(qū)，可獨立復(fù)制。 （一） 質(zhì)粒 ◆ 質(zhì)粒 (plasmid)是細菌染色體外存在的一種能夠自我復(fù)制的雙鏈閉合環(huán)狀 DNA分子，大小 1kb～ 200kb。 作為載體 DNA分子，需要具備： ?在宿主細胞中能獨立復(fù)制，有獨立的復(fù)制起始位點； ?載體 DNA分子中有一段不影響其復(fù)制的 非必需區(qū)域，即有限制酶切位點，允許外源基因插入且插入后隨載體 DNA分子一同進行復(fù)制或擴增； ?有選擇標(biāo)記，便于選擇含重組 DNA分子的寄主細胞； ?分子量小，多拷貝，易于操作。 ● 復(fù)性 ： 兩個引物分別與單鏈 DNA互補復(fù)性，復(fù)性的溫度在 5060℃ ● 延伸 ：在引物的引導(dǎo)及 Taq酶的作用下，于 72℃ 合成模板 DNA的互補鏈 ◆ 這三個步驟稱為一個循環(huán)，PCR反應(yīng)常有 2535個循環(huán)。 （四） PCR ◆ 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (polymerase chain reaction， PCR) 是體外快速擴增 DNA的方法 。 （三） 反轉(zhuǎn)錄酶 （ reverse transcriptase） ★ 反轉(zhuǎn)錄酶是一類以RNA為模板來指導(dǎo)DNA合成的 DNA聚合酶，所以又稱為依賴于RNA的 DNA聚合酶。 （一） 限制性內(nèi)切核酸酶 （一） 限制性內(nèi)切核酸酶 通過用相同的限制性內(nèi)切核酸酶切割形成一個重組 DNA分子 （一） 限制性內(nèi)切核酸酶 （二） DNA連接酶（ ligase） ?在分子克隆中使用的 DNA連接酶有兩種：大腸桿菌 DNA連接酶和 T4 DNA連接酶。 ① 有特異識別和切割的序列部位 ， 被切割的 DNA分子形成單鏈的斷裂； ② 斷裂的部位通常不是直接相對的 ， 結(jié)果所形成的 DNA片段常具有堿基互補的單鏈尾巴 （ 粘性末端 ） ， 使其能夠重新連接； ③ 內(nèi)切酶的切割和修飾功能由兩個不同的酶催化所完成 。 ?Ⅰ 型酶：只有 EcoB和 EcoK兩種 ， 具有催化限制性切割和修飾核苷酸 2種功能 。 （一） 限制性內(nèi)切核酸酶 ★ 共同的特性： ?只切割雙鏈 DNA分子，不切單鏈 DNA； ?每種酶有其特定的核苷酸序列識別特異性； ?需要鎂離子激活等。通過某些堿基進行甲基化修飾，使得限制酶不能進行切割。 第 1節(jié) 基因工程概述 ?目的基因的獲 ?目的基因與載體的連接成重組 DNA分子 ?重組 DNA分子導(dǎo)入受體細胞 ?篩選重組克隆 ?基因表達與產(chǎn)物分離 基因工程的內(nèi)容 第 1節(jié) 基因工程概述 第 2節(jié) 基因的分離 一 工具酶 二 載體 三 基因分離方法 第 2節(jié) 基因的分離 一、工具酶 （一） 限制性內(nèi)切核酸酶 (restriction enzymes) 限制性內(nèi)切核酸酶（限制酶）是細菌中降解外來 DNA分子的一類酶。 細胞工程（ cell engineering） 基因工程（ gene engineering） 酶工程（ enzyme engineering） 發(fā)酵工程（ fermentation engineering） 第 1節(jié) 基因工程概述 ?基因工程（ gene engineering） ?利用人工的方法把生物的遺傳物質(zhì)在體外進行切割、拼接和重組，獲得重組 DNA分子，然后導(dǎo)入宿主細胞或個體，使受體的遺傳特性得到修飾或改變的過程。第 11章 基因工程 第 1節(jié) 基因工程概述 第 2節(jié) 基因的分離 第 3節(jié) 外源基因?qū)胧荏w 第 4節(jié) 轉(zhuǎn)基因生物的檢測與鑒定 第 5節(jié) 基因工程的應(yīng)用 ?遺傳工程（ geic engineering），也稱生物工程，利用工程技術(shù)的方法改造和修飾生物體，使其產(chǎn)生新的性狀或產(chǎn)品，從而改良生物體的一種遺傳學(xué)手段。 ?核心是利用重組 DNA技術(shù)，在分子水平上操作修飾改變生物體。 ?基因工程操作的對象是 DNA分子， 首先 把目標(biāo)基因克隆出來插入到一定的載體中， 然后 將重組 DNA分子導(dǎo)入到受體細胞，并使其保持和遺傳下去。 細菌中限制 — 修飾現(xiàn)象： 作用于同一 DNA的兩種酶 —— 分解 DNA的 限制酶 和改變 DNA堿基結(jié)構(gòu)使其免遭限制酶分解的 修飾酶 。而外來的 DNA在沒有被甲基化，限制酶將其降解。 ★ 限制酶可分為 3類。 ?Ⅱ 型酶：在遺傳工程中應(yīng)用最廣泛 。 ?Ⅲ 型酶具有特異的識別位點 ， 這種識別位點是非對稱的 。 ?催化 DNA中相鄰的3’ –OH和 5’ – 磷酸基末端之間形成磷酸二酯鍵并把兩段 DNA連接起來。 ★ 反轉(zhuǎn)錄酶在遺傳工程中的主要用途是以mRNA為模板合成cDNA。 ◆ PCR反應(yīng)包括三個步驟： ● 變性： 在 9495℃ 使模板 DNA的雙鏈變性成單鏈。 ◆ （四） PCR PCR產(chǎn)物可以通過電泳檢測 瓊脂糖電泳 聚丙烯酰胺凝膠電泳 二 載體 載體（ vector）是將外源基因送入受體細胞的工具。 除了上述特點外，一般還要求載體載荷外源 DNA的幅度要寬，具有安全性等。 ?質(zhì)粒常常帶有一些特殊的基因，如致死基因，抗抗生素的基因等等。 ?質(zhì)粒 DNA復(fù)制與宿主之間的關(guān)系，可分為“嚴(yán)謹(jǐn)型”和“松弛型”。 ◆ 一般質(zhì)粒通過改造后才能用于遺傳工程。 ?有一個多克隆位點，位于大腸桿菌的 lacZ基因之內(nèi)，有利于篩選和分離轉(zhuǎn)化細胞。 （一） 質(zhì)粒 （二） 病毒載體 ◆ λ噬菌體基因組 全長48kb。 中間約 1/3的序列為中間基因簇(central gene cluster)，兩端為 DNA左、右臂。 λ噬菌體 （二） 病毒載體 ◆ λ噬菌體載體可接受 15 kb23 kb的外源DNA片段，它既可作為克隆載體，也可作為表達載體，廣泛用于各類基因庫的構(gòu)建。 ?粘粒載體 （ cosmid） 是一類含有 cos位點的質(zhì)粒載體 . ?兼有 λ噬菌體的高效感染能力和質(zhì)粒的易于克隆和選擇的優(yōu)點， 既能像質(zhì)粒一樣在寄主細胞內(nèi)復(fù)制，又能象λDNA一樣被包裝到噬菌體顆粒中去。 由于 cosmid載體的大片段克隆能力，多 用于基因組文庫的構(gòu)建，而 λ噬菌體載體多用于 cDNA文庫的構(gòu)建 。 F因子在細菌接合時轉(zhuǎn)移 1Mb的細菌染色體片段。 ◆ 帶有外源片段的 BAC載體在細菌細胞中通常僅單個拷貝，這一特點有利于保持 DNA大分子，在細胞內(nèi)穩(wěn)定復(fù)制而不