【正文】 抗性標記，原核細胞篩選。 質(zhì)粒載體： 微生物的質(zhì)粒載體類似，一般是穿梭質(zhì)粒，具有兩個復制子和抗性篩選標記基因。無感染性和致癌性，可用于構(gòu)建基因工程疫苗。 同源重組構(gòu)建腺病毒載體，在靜止期轉(zhuǎn)染細胞，表達時間較長。 第二節(jié) 基因工程動物細胞系的構(gòu)建 構(gòu)建高效表達載體 轉(zhuǎn)染動物細胞 篩選鑒定 獲得生產(chǎn)用工程化細胞系 動物細胞的表達載體：病毒載體，質(zhì)粒載體。 表達水平非常高 ， 加工裝備跟不上 ， 蛋白質(zhì)修飾效率可能不高 。 2） 外源基因的表達在轉(zhuǎn)染的晚期 ， 大約在 20h后起始基因表達 ， 在 72－ 94h細胞裂解死亡 ， 基因表達時間約 30－50h， 高水平表達不連續(xù)且時間短 ， 這對表達不利 。 5） 翻譯后的加工：昆蟲細胞能進行一系列翻譯后的加工 ，包括糖基化 、 脂肪酸?；?、 磷酸化 、 氨基酸的乙?；?、氨?；?， 大部分產(chǎn)物顯示出良好的活性 。 4） 高效表達：可容納較大的外源基因 （ 12kb） ， 表達數(shù)個外源基因 ， 并且正確裝配成有功能的分子 。 2） 易飼養(yǎng)：家蠶喪失了野外生存能力 ， 飼養(yǎng) ， 發(fā)育快 ， 3） 高量表達：用強啟動子 ， 外源基因可超量表達 。 至少有 600多種昆蟲可以作為宿主 ， 每年有數(shù)百個基因利用昆蟲系統(tǒng)進行表達 ， 越來越成為非常有用的表達宿主 。 日本批準用家蠶系統(tǒng)生產(chǎn)干擾素已上市 。 苜蓿尺蠖核多角體病毒－秋黏蟲細胞表達系統(tǒng) ， 家蠶核多角體病毒－家蠶幼蟲表達系統(tǒng) 。 3. 昆蟲細胞表達系統(tǒng)與特征 表達載體為昆蟲病毒 ， 轉(zhuǎn)染昆蟲細胞 ， 表達出目標蛋白質(zhì) 。 同時可能有潛在的致病因子 、 免疫原性存在 。 動物細胞對培養(yǎng)條件要求苛刻和敏感 ， 對溫度 、 pH、 滲透壓 、 剪切力等忍受能力差 。 骨髓細胞 MPG－ 11生產(chǎn) IgG的能力為 5pg/(細胞 .分鐘 )，10L反應器 ， 密度為 107/ml， 生產(chǎn)能力不到 1g/d。 約有 70％ 批準的蛋白質(zhì)藥物由哺乳動物細胞系統(tǒng)表達制造 ， 而且數(shù)目還在不斷增加 。 原核表達的GM－ CSF雖有活性 ， 但在體內(nèi)產(chǎn)生抗體 。 糖基化等修飾是糖蛋白行使功能所必需的 ， 而且對產(chǎn)品質(zhì)量有影響 ， 如生物活性 、 穩(wěn)定性 、 免疫原性等 。 細胞系 Fuc Gal 唾液酸 α1,6 α 1 , 3 Fuc α1 , 3Gal SO4 GalNAc α 2 ,3 α2,6 糖基化 等分GluNAc BHK ++ 0 + 0 ++ 0 0 CHO ++ 0 0 ++ 0 + 0 鼠雜交瘤 ++ 0 ++ 0 ++ 0 +++ 0 C127 ++ 0 ++ ++ ++ ++ +++ 0 J558L ++ 0 ++ ++ ++ +++ 0 人淋巴細胞 ++ 0 0 0 + + 0 ++ 人垂體 ++ 0 0 +++ + + 0 ++ Namalwa ++ 0 0 0 ++ ++ 人鼠雜交瘤 ++ 0 0 0 + + + 0 2. 哺乳動物細胞表達系統(tǒng) 基因工程哺乳動物細胞系：失去分化能力的無限生長細胞系 ， 即永久性細胞 。 CHO細胞不能合成等分 N乙酰葡萄糖胺，而鼠細胞系卻能形成半乳糖末端，對人有免疫原性。 盡管哺乳動物細胞具有細胞內(nèi)的糖基化裝置，但不同細胞系，糖基化特征不同。 IgG蛋白的鉸鏈區(qū) ， 富含 Ser、 Thr和 Pro， 5個 Ser全部糖基化 。 細胞特異性糖基化途徑 —— 淋巴細胞中進行 ， 它不依賴于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體 。 膽胺形成膜內(nèi)蛋白的橋 ， 而肌醇在膜內(nèi) 。 O糖基化只在高爾基體上進行 ， 糖基單元有木糖 、 葡萄糖 。 O聚糖有四種不同的核心結(jié)構(gòu) ， 都含有 N乙酰半乳糖胺基 ， 糖基化會影響蛋白質(zhì)的局部構(gòu)象 。 雜合型至少含有一條復合糖鏈 ， 另一個鏈含有甘露糖 。 高甘露糖型的支鏈為甘露聚糖 （ 5～ 9聚體 ） ， 無其他糖 。 如果 X為 Trp、 Asp、 Glu和 Leu， 對糖基化有負影響 ， 而第三位 Thr能增強糖基化 。 這兩種糖基化的位點和數(shù)量及糖的種類都不同 。 糖蛋白的單糖單元 :αD葡萄糖 、 αD半乳糖 、 αD甘露糖 、 αD木糖 、 αD巖藻糖 、 N乙酰 αD葡萄糖胺 、 N乙酰 αD半乳糖胺和 αN乙酰神經(jīng)氨酸 （ 或唾液酸 ） 。 3. 蛋白質(zhì)糖基化 蛋白質(zhì)合成是以 mRNA為模板 ， 在核糖體上完成 。能量是以 ATP和NADPH的形式提供，來源于葡萄糖和谷氨酰氨，但二種細胞系對各個代謝途徑的貢獻和所起的作用不同。在正常細胞系中，丙酮酸羧化產(chǎn)生草酰乙酸，而草酰乙酸來源于谷氨酰胺。在快速生長的動物細胞培養(yǎng)體系，轉(zhuǎn)氨作用是主要的代謝途徑。所以谷氨酰胺在細胞能量代謝中具有重要作用。小部分谷氨酰胺通過轉(zhuǎn)氨生成其他嘌呤、嘧啶和氨基糖等合成代謝的前體。 氨基酸代謝特點： 吸收谷氨酰胺后，進入氨基酸代謝途徑，通過脫氨、轉(zhuǎn)氨等作用，合成其他必需和非必需氨基酸。小部分（ 4％～ 8％）葡萄糖進入戊糖磷酸途徑，把葡萄糖轉(zhuǎn)化為 7碳糖和還原力NADPH， 5碳糖用于核酸合成，其他中間產(chǎn)物進入脂肪酸代謝、核酸代謝和氨基酸代謝。 糖代謝特點： 動物細胞吸收葡萄糖后，進行糖酵解，大部分葡萄糖分解為丙酮酸，進一步被還原為乳酸，乳酸分泌到胞外并在培養(yǎng)液中積累。 葡萄糖受限可增加谷氨酰胺的消耗得以補償 ， 反之亦然 。 通過胞內(nèi)運輸 （ 囊泡包裹 ） 實現(xiàn)區(qū)域之間的物質(zhì) 、 信息和能量流動 ， 通過穿梭實現(xiàn)不同代謝途徑之間的交換 。 亞細胞器 ， 功能獨特 。 第一節(jié) 動物細胞制藥的表達系統(tǒng)與特征 昆蟲系統(tǒng) 、 哺乳動物細胞系統(tǒng) ， 最成功 、 重要表達活性外源蛋白的有效系統(tǒng) ， 應用于藥物蛋白質(zhì)的表達 。 干擾素 、 單克隆抗體 、 重組基因工程產(chǎn)品 。 動物細胞的培養(yǎng)技術(shù)來生產(chǎn)有功能的蛋白質(zhì) ， 大規(guī)模動物細胞特別是人源細胞的培養(yǎng)在藥物生產(chǎn)中的位置會越來越重要 。基因工程動物細胞培養(yǎng)制藥工藝 藥用蛋白質(zhì)的合成復雜 ， 要有精確折疊的空間結(jié)構(gòu) ，要有糖基化 ， 才能使藥物發(fā)揮真正的功能 。 細菌和酵母等產(chǎn)品要么是包涵體 ， 要么難以糖基化功能修飾 。 人畜病毒疫苗 :口蹄疫苗 、 狂犬病疫苗 、 牛白血病和脊髓灰質(zhì)炎 、 乙肝疫苗 。 組織型血纖蛋白溶酶原激活劑 、 免疫珠蛋白 G、 M、 尿激酶 、 人生長因子等 。 一 、 哺乳動物細胞表達系統(tǒng)與特征 1. 動物細胞的特征 細胞膜 、 細胞質(zhì) 和細胞核 沒有細胞壁 。 2. 動物細胞代謝 動物細胞的不同代謝途徑及其相應的酶體系定位于特定的亞細胞區(qū)域 。 在動物細胞培養(yǎng)中 ， 葡萄糖和谷氨酰胺提供能量并作為合成代謝的前體 ， 因此動物細胞的培養(yǎng)具有一定的靈活性 。谷氨酰胺是動物細胞的氮源 ， 谷氨酰胺受限時 ， 可增加其他氨基酸的消耗得以補償 。 丙酮酸還可轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶 A，進入三羧酸循環(huán)，徹底氧化產(chǎn)生 CO2和水。 葡萄糖代謝旺盛，會產(chǎn)生大量的乳酸，對細胞產(chǎn)生毒性。 大多數(shù)谷氨酰胺在脫氨酶催化下，生成谷氨酸，并釋放氨，對細胞產(chǎn)生毒性。 谷氨酸還原酶把谷氨酸轉(zhuǎn)化為中間產(chǎn)物 α 酮戊二酸，進入三羧酸循環(huán)，為細胞提供能量。谷氨酰胺與丙酮酸和草酰乙酸發(fā)生轉(zhuǎn)氨作用，生成丙氨酸和天門冬氨酸，丙氨酸可進入培養(yǎng)液并積累。 不同的培養(yǎng)條件，葡萄糖和谷氨酰胺代謝重疊于丙酮酸。 在連續(xù)細胞系中，沒有這種流動。 常流加葡萄糖或谷氨酰氨，控制整個代謝過程，避免有毒廢物積累。 而蛋白質(zhì)的糖基化無需模板指導 ， 因此糖蛋白的寡糖結(jié)構(gòu)容易發(fā)生變化 。 糖基化類型：寡糖基以共價鍵與蛋白質(zhì)的氮原子結(jié)合為 N糖基化 ， 或與氧原子結(jié)合為 O糖基化 。 N糖基化：聚糖部分連接在天門冬酰胺的氨基上 ， 其模體的保守序列為 AsnXThr/Ser (X為除脯氨酸以外的任意氨基酸 )。 N糖基化分為高甘露糖型 、 復合型和雜合型三種類型 ， 共同核心是 3個甘露糖和 2個 N乙酰葡萄糖胺組成的 5糖（ Man3GluNAc2） ， 其他糖形成支鏈 。 復合型含有 2個以上支鏈 ， 如乙酰半乳糖胺 、 果糖和唾液酸等 。 O聚糖連接在 Thr/Ser的羥基上 ， 還沒有發(fā)現(xiàn)保守序列 。 O糖基化比較小 ， 一般為 1～ 6個寡聚糖 ， 但比 N糖基化變化更大 。 糖基化磷脂酰肌醇錨著點：它在膜與蛋白質(zhì)之間形成穩(wěn)定的相互作用 ， 都具有相同的核心結(jié)構(gòu)：膽胺 PO4Man2GlcHN2肌醇 PO4脂 。 在細胞培養(yǎng)生產(chǎn)重組蛋白時 ， 磷脂酶 C可切割此類蛋白 ，有利于純化 。 IgG的糖基化 ， 等分 GlcNAc殘基連接在核心甘露糖上 ， 該糖基化在抗體依賴性細胞介導的細胞毒性中起重要作用 。 促黃體激素 、 促甲狀腺素等的硫酸化只能在垂體中發(fā)生 。 鼠和豬細胞傾向于添加乙酰果糖而不是乙酰唾液酸，在鼠雜交瘤或人鼠雜交瘤生產(chǎn)的抗體中，乙酰果糖占優(yōu)勢。 要根據(jù)糖基化的結(jié)構(gòu)，選擇適宜的細胞系。 表達的蛋白質(zhì)能正確加工 、 修飾并折疊形成具有生物活性的功能分子 ， 接近或類似天然產(chǎn)物 。 原核細胞表達的 EPO無糖基化 ， 在體內(nèi)表現(xiàn)無活性 。 動物細胞表達產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)液 ， 容易分離純化 。 表達系統(tǒng) O糖基化 寡聚甘露糖 高甘露糖 復合體 大腸桿菌 0 0 0 0 釀酒酵母 ＋＋ 0 ＋＋＋＋ － 昆蟲 Sf9 ＋＋ ＋＋＋＋ 0 － 倉鼠 CHO ＋＋ ＋＋ 0 ＋＋ 倉鼠 BHK ＋＋ ＋＋ 0 ＋＋ 鼠雜交瘤 ＋＋ ＋＋ 0 ＋＋ 鼠骨髓瘤 ＋＋ ＋＋ 0 ＋＋ C127 ＋＋ ＋＋ 0 ＋＋ J558L ＋＋ － 0 ＋＋ 人淋巴細胞 ＋＋ 0 0 ＋ Namalwa ＋＋ ＋＋ 0 ＋＋ 人鼠雜交瘤 － ＋＋ 0 ＋＋ 大腸桿菌 酵母 哺乳動物細胞 產(chǎn)物濃度 高 高 低 分子量 低 高 高 二硫鍵 有限 不受限制 不受限制 分泌 無 有或無 有 形式 包涵體 單鏈 ， 天然 單鏈 ， 天然 折疊 不正確 正確 正確 糖基化 無 可能 完全 逆轉(zhuǎn)錄病毒 無 無 可能 熱原 可能 無 無 培養(yǎng)特點 容易 容易 較難 ， 成本高 分離純化 復雜 復雜 簡單 細胞類型 表 達 水 平（ μg/ml） 猴 CV1 1～ 10 猴 CV1 猴 COS 1 小鼠成纖維細胞 C127 1～ 5 小鼠成纖維細胞 3T3 ～ CHO（ dhfr－ ） ~ CHO（ dhfr－ ） 10 動物細胞表達系統(tǒng)的不足是細胞生長緩慢 ， 生產(chǎn)