【正文】 chromosome, BAC) (5) 酵母人工染色體 (Yeast artificial chromosome, YAC) ? 表達(dá)載體 (Expression vector) 用于表達(dá)某一基因或 cDNA以 獲得目的蛋白質(zhì) 。 依賴 DNA的 DNA聚合酶 ? 逆轉(zhuǎn)錄酶無 3’ ?5’ 外切酶活性。 蛋白酶酶切位點(diǎn) Klenow 片段 5’ GAATTC 3’ 3’ CTTAAG 5’ EcoRI 5’ G 3’ 5’ AATTC 3’ 3’ CTTAA 5’ 3’ G 5’ Klenow, dNTPs 5’ GAATT 3’ 5’ AATTC 3’ 3’ CTTAA 5’ 3’ TTAAG 5’ 5’ ?3’ 聚合酶活性 ： 補(bǔ)平 限制性內(nèi)切酶酶切所產(chǎn)生的 3’ 凹端而形成平端 5’ GGTACC 3’ 3’ CCATGG 5’ KpnI 5’ GGTAC 3’ 5’ C 3’ 3’ C 5’ 3’ CATGG 5’ Klenow 5’ G 3’ 5’ C 3’ 3’ C 5’ 3’ G 5’ 3’ ?5’ 外切酶活性 ： 去除 限制性內(nèi)切酶酶切所產(chǎn)生的3’凸端而形成平端 逆轉(zhuǎn)錄酶 (Reverse transcriptase， RT) ? 逆轉(zhuǎn)錄酶為 依賴 RNA的 DNA聚合酶 ，具有 5’ ?3’ 聚合酶活性外，以 RNA為模板合成 DNA。羥基末端磷酸化 DNA 核酸酶 I (DNA nuclease I) S1 核酸酶 (S1 nuclease) 外切核酸酶 III (Exonuclease III) ? 外切核酸酶 (? Exonuclease) 2. 修飾酶 (Modifying enzymes) T4 DNA 連接酶 , ATP TGCTTAA 5’ 3’ ACG OH 3’ P 5’ AATTCGT GCA 3’ 5’ 5’ P 3’ OH TGCTTAA 5’ 3’ ACG AATTCGT GCA 3’ 5’ T4 DNA 連接酶 (T4 DNA ligase) 催化 DNA 的 3’OH 和 5’P 之間形成 磷酸二酯鍵 連接 帶 粘性末端 的兩個(gè) DNA 分子 T4 DNA連接酶 , ATP ACG 5’ 3’ TGC OH 3’ P 5’ TAGCCGT ATCGGCA 3’ 5’ 5’ P 3’ OH 5’ 3’ TGCTAGCCGT ACGATCGGCA 3’ 5’ 連接 帶 平端 的兩個(gè) DNA 分子 粘性末端 平端 DNA聚合酶 I Klenow片段 Klenow片段是 DNA 聚合酶 I 的羧基端片段，長度為全酶的 70％。 不同的酶可以識別同一個(gè)序列 酶活性單位 ：在 37?C (某些限制性內(nèi)切酶用 25?C 或 50?C) 條件下，每 1小時(shí)酶切 1 ?g DNA 所用的酶量。這兩個(gè)相同的黏端稱為 配伍末端 (patible end)。 5’ GGATCC 3’ 5’ GGA TCC 3’ 3’ CCTAGG 5’ 3’ CCT AGG 5’ 5’ AGATCT 3’ 3’ TCTAGA 5’ 5’ CCCGGG 3’ 3’ GGGCCC 5’ 命名 屬名 (genus ) 的第一個(gè)字母，用大寫表示 種名 (species ) 的前兩個(gè)字母，用小寫表示 細(xì)菌株名 (strain)， 用大寫或小寫表示 同一細(xì)菌株中不同的限制性內(nèi)切酶被發(fā)現(xiàn)和分離的順序，用羅馬字表示。 “ 內(nèi)切酶 ”是指 酶切位點(diǎn) 在 DNA 分子內(nèi)，而不是兩端。 “ 限制性 ” 只降解外源 DNA 而不降解宿主 DNA； 細(xì)菌存在甲基化酶 ，對限制性內(nèi)切酶識別序列中腺苷酸和胞苷酸進(jìn)行甲基化而 不被限制性內(nèi)切酶所剪切 。重新組合在一起 DNA片段稱作 重組 DNA 分子 。 ? 分子克隆 (Molecular cloning) 利用 DNA 重組技術(shù) 可使 一個(gè)基因或 DNA 片段 產(chǎn)生出 許多 相同的拷貝。 細(xì)菌基因組 大腸桿菌： 4 x 106 bp 人類基因組： 3 x 109 bp ? 克隆 (Clone) 指用 無性繁殖 方法產(chǎn)生一組 遺傳上相同的細(xì)胞 和生物群 體過程。 DNA連接酶 基因工程 (Geic engineering) D N A R N A P r o t e i nT r a n s c r i p t i o n T r a n s l a t i o nR e v e r s et r a n s c r i p t i o nD N Ar e p l i c a t i o nR NAr e p l i c a t i o n(Central dogma) ? 基因 (Gene) 能編碼一條多肽鏈并具有一定長度的 DNA 分子。 T C A G G T G A T C T G G 539。 A G T C A T C A G A C C C 339。 磷酸二酯鍵的形成 539。 親代 DNA 復(fù)制 子代 DNA ?DNA雙螺旋解開成為單鏈，用于合成新的互補(bǔ)鏈 . 子代 DNA雙鏈中一股單鏈?zhǔn)菑挠H代完整地接受過來 另一股單鏈按堿基配對原則完全重新合成 半 保 留 復(fù) 制 DNA復(fù)制的酶及蛋白因子 ? dNTP(dATP,dGTP,dCTP,dTTP) ? DNA聚合酶 （ DNA依賴的 DNA 聚合酶 ) DNApol ? 單鏈的 DNA母鏈 ? 寡核苷酸引物（ RNA) ? 拓?fù)洚悩?gòu)酶、 單鏈DNA結(jié)合蛋白 ，連接酶 解旋酶、引物酶 多種蛋白因子 DNA聚合酶 （ DNA polymerase， DNApol） —以 DNA為模板，催化 339。 堿基平面垂直螺 旋軸，相鄰堿基平面距離為 nm， 螺旋一圈包含 10 對堿基。2 nm 大溝 ( nm) 小溝 ( nm) nm DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu)要點(diǎn) (Watson 和 Crick， 1953) 1. DNA 由兩條反相平行的脫氧核苷酸鏈 組成，脫氧核糖 磷酸骨架位于雙鏈的 外側(cè)，堿基位于內(nèi)側(cè)，雙鏈的堿基之 間以氫鍵相結(jié)合。 堿基互補(bǔ)配對形式： A ? T； G? C) 2. DNA 是右手螺旋結(jié)構(gòu)，螺旋直徑為 2 nm， 螺距為 nm。 3. 氫鍵維持 DNA 雙鏈橫向穩(wěn)定性，堿基 堆積力維持雙鏈縱向穩(wěn)定性。 5 39。 339。 539。 G T C T G G A G A C C C 539。 ? 基因組 (Genome) 一種生物全部染色體的遺傳物質(zhì)的總和，以全長 DNA 的堿基對 (bp) 數(shù)目表示。這些細(xì)胞或個(gè)體均來自無性繁殖單一原形細(xì)胞。 ? DNA 重組技術(shù) (Rebinant DNA techniques) 利用 限制性內(nèi)切酶 、 連接酶 等在 體外 將 不同 生物體的 DNA 片段 進(jìn)行 重新組合 的技術(shù)。 基因組 DNA 克隆 載體 限制性內(nèi)切酶消化 限制性內(nèi)切酶 消化、電泳分離、純化 DNA 連接酶 重組載體 轉(zhuǎn)化 或轉(zhuǎn)導(dǎo) 大腸桿菌宿主細(xì)胞 細(xì)胞 增殖 分 子 克 隆 的 基 本 過 程 重組載體 在大腸桿菌宿主細(xì)胞中復(fù)制以產(chǎn)生許多相同的分子拷貝 基因組 DNA 載體 (環(huán)狀 DNA) 可被克隆的 DNA 片段 線狀 DNA 載體 篩選 含目的基因的重組子 限制性內(nèi)切酶 限制性內(nèi)切 酶 轉(zhuǎn)化 或轉(zhuǎn)導(dǎo)大腸桿菌 重組 DNA 分子 組 織 mRNA cDNA 部分或全部酶切的 DNA 加銜接物分子 DNA 連接 酶 反轉(zhuǎn)錄 ? 工具 酶 ? 載體 ? 目的基因 基因組 DNA 文庫篩選 PCR 產(chǎn)物 cDNA文庫篩選 RTPCR 產(chǎn)物 化學(xué)合成 ? 宿主細(xì)胞 ? 導(dǎo)入 重組 DNA 分子 到宿主細(xì)胞 ? 篩選 攜帶目的基因的宿主細(xì)胞 分子克隆 的所需的 條件 工具酶 和修飾酶 (Restriction endonucleases and modifying enzymes) 一類存在于細(xì)菌中的核酸內(nèi)切酶，它們 識別雙鏈 DNA 分子上 特異的核苷酸 序列，并對 DNA 分子進(jìn)行 剪切 。這就構(gòu)成了細(xì)菌的 “ 限制 修飾系統(tǒng) ” 的分子基礎(chǔ)。 限制性內(nèi)切酶 (Restriction endonucleases) 類型 A TP 組成 識別序列 酶切位點(diǎn) 甲基化酶活性I 需要 由三種亞基組成的復(fù)合物兩側(cè)不對稱序列在離識別序列至少 1000 個(gè)堿基處酶切 DNA有II 不需要 單鏈多肽 為 4 6 個(gè)堿基，常具有回文結(jié)構(gòu)酶切位點(diǎn)在識別序列之中或其相鄰位置無III 需要 由二種亞基組成的復(fù)合物兩側(cè)不對稱序列在離識別序列 3 ’端的 2 4 2 6 個(gè)堿基處酶切 DNA有限制性內(nèi)切酶的 分類 回文結(jié)構(gòu) (palindrome) 是雙鏈 DNA 分子中的反向重復(fù) 結(jié)構(gòu)，即每條鏈從 5’? 3’ 方向讀其核苷酸序列都相同。 類型 II 限制性內(nèi)切酶 同一細(xì)菌株中不同的限制性內(nèi)切酶被發(fā)現(xiàn)和分離的順序，用羅馬字表示 屬名 (大寫 ) EcoRI 種名 (小寫 ) 細(xì)菌株名 (大寫 ) Escherichia 屬 coli 種 R株 識別序列 (1) 具 有 回文結(jié)構(gòu) BamHI 5’ G?GATCC 3’ 3’ CCTAG?G 5’ KpnI 5’ GGTAC?C 3’ 3’ C?CATGG 5’ (2) 具有 間斷的回文結(jié)構(gòu) HinfI (XmnI) 5’ G?ANTC 3’ 3’ CTNA?G 5’ (3) 具有 簡并性堿基 HincII 5’ GT(T/C)?(A/G)AC 3’ 3’ CA(A/G)?(T/C)TG 5’ (4) 無回文結(jié)構(gòu) MboII 5’ GAAGA(N)8? 3’ 3’ CTTCT(N)7? 5’ GAATTC CTTAAG CTTAA 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ G AATTC G 5’ P 3’ OH OH 3’ P 5’ CTGCAG GACGTC 5