【正文】 (溶液仍有較好的流動(dòng)性 )，最大體積的給藥量 1次或 1日內(nèi) 2～ 3次給予動(dòng)物。岡此，采用較簡(jiǎn)單的計(jì)算方法完全可以滿足 LD50計(jì)算的準(zhǔn)確性。 LD50和最小致死量及其可信限的汁算可采用 Bliss法，改進(jìn)寇氏法、點(diǎn)斜法、簡(jiǎn)化概率單位法或其他的計(jì)算方法。各給藥組和溶劑對(duì)照組按體重給藥后，試驗(yàn)當(dāng)日應(yīng)多次觀察，第二日至最后 — 日應(yīng)每日有二人以上同時(shí)觀察 1次并及時(shí)詳細(xì)汜錄毒性反應(yīng)癥狀，癥狀出現(xiàn)和消失的時(shí)間，死亡時(shí)間，第七日全部動(dòng)物測(cè)量體重處死并剖檢，肉眼觀察病變情況。 正式試驗(yàn)：在預(yù)試驗(yàn) Dn和 Dm劑量范圍內(nèi)按等比設(shè)三個(gè)以上劑量組，其組間劑量的比值，一般在 1； 0． 6至 1： 0． 9范圍內(nèi)。觀察 7日，記錄死亡動(dòng)物數(shù)。更確田地說(shuō)是找到 — 個(gè) 0死亡的最大劑量和 100％死亡的最小劑量的估值以決定實(shí)驗(yàn)中采用的最大劑量 (Dm)和最小劑量 (Dn)，這在測(cè)定中非常重要，是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。 第二節(jié) 急性毒性試驗(yàn)方法 一、 LD50的測(cè)定 最小致死量是使動(dòng)物剛好致死的藥物劑量，但由于藥物的性質(zhì)，給藥方法和個(gè)體差異，每只動(dòng)物的最小致死量確很大的差異，實(shí)驗(yàn)和統(tǒng)訓(xùn)學(xué)原理表明一群動(dòng)物最小致死量的平均值相當(dāng)于半數(shù)致死量。但各種方法還各有特殊設(shè)計(jì)要求，如有的要求 Dm和 Dn必須為 100％和 0％死亡率等，可參考有關(guān)專著，此處不贅述。但近代有計(jì)算機(jī)軟件，汁算方法可推薦Bliss法。 (二 }致死劑量計(jì)算 可用 Bliss點(diǎn)斜法、簡(jiǎn)化機(jī)率法、改進(jìn)寇氏序貫法等計(jì)算最小致死量或半數(shù)致死量。應(yīng)每日記錄體重、毒性反應(yīng)和死亡情況，瀕死動(dòng)物應(yīng)單獨(dú)飼養(yǎng)，死后及時(shí)解削進(jìn)行肉眼觀察和病理組織學(xué)觀察。給藥前后應(yīng)觀察體重、進(jìn)食、進(jìn)水的狀況，密切觀察異常毒性癥狀，特別是給藥后的一、二日。 四、急毒試驗(yàn)觀察指標(biāo)和致死量的計(jì)算 (一 )觀察指標(biāo) 不能把求得致死劑量看作是急性毒性實(shí)驗(yàn)的唯一要求。小鼠口服最大容量不超過(guò) 0． 8ml／ 20g(體重 )，其他途徑不超過(guò)0． 5ml／ 20g(體重 )。腹腔汁射在人體極少用，中藥粗制劑成分復(fù)雜，動(dòng)物毒性試驗(yàn)中也盡可能少用，以避免腹腔刺激性的干擾。 三、給藥方法 (一 )動(dòng)物禁食 動(dòng)物購(gòu)入后應(yīng)在實(shí)驗(yàn)室觀察 1星期，口服給藥前，為減少吸收差異和大容量給藥造成胃急性擴(kuò)張，小鼠和大鼠至少應(yīng)停食 4 6h，要求一夜停食 (不停水 )，投藥后再停食 34h。 濃度一定適用于某些已經(jīng)固定濃度的制劑，其有利之處是避免了滲透、粘度、溶質(zhì)顆粒的分散狀態(tài)等理化性狀不 — 致對(duì)毒性試驗(yàn)結(jié)果的影響，因此，濃度一定也可得到較好的結(jié)果，但由于動(dòng)物的投藥用量是有限的，范圍較窄，按體重給藥容量難以達(dá)到試驗(yàn)要求。 (二 )樣品液的濃度及給藥容量 為了求得最低致死且或半數(shù)致死量，需要設(shè)不同劑量組，使部分組反應(yīng)率在 50％以上，部分組反應(yīng)率在 50％以下。 (一 )樣品液的配制 中藥材町用濃縮煎劑或浸膏，中藥制劑可用不含輔料的提取物加水或用 o． 5％羧基纖維素鈉， 0． 5％吐溫 — 80， 5％阿拉伯膠等混懸劑、增溶劑配成混懸液等，盡可能配成水溶液，水不溶性成分可用植物汕配成油溶、乳濁液。最大給約量試驗(yàn) — 般要求用小鼠或大鼠 20只即可。一些國(guó)家對(duì)動(dòng)物數(shù)和組數(shù)不作規(guī)定，因此，有只用 3只一組經(jīng)多組試驗(yàn)測(cè)得近似致死量或 LD50者。 (三 )動(dòng)物數(shù)量 視不同試驗(yàn)而異。未成年的動(dòng)物藥酶活性一般較低，對(duì)于經(jīng)代謝后減毒的藥物表現(xiàn)毒性較強(qiáng)。但在某些特殊情況下，例如受試物中已知含有強(qiáng)烈胃腸刺激物，就還應(yīng)再采用非嚙齒類大動(dòng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，否則，即使毒性較大 (如巴豆 )也并不能引起大、小鼠嘔吐反應(yīng)。由于中藥已在臨床長(zhǎng)期使用，一般認(rèn)為，如尤特殊情況，使用一種動(dòng)物已基本上達(dá)到急性毒性試驗(yàn)的目的。 第一節(jié) 急性毒性試驗(yàn)方法的有關(guān)問(wèn)題 一、動(dòng)物 (一 )動(dòng)物種 動(dòng)物種 (或系 )的差異是動(dòng)物急性毒性差異的主要原因，藥酶則是毒性種差的重要原因之一。因此，急性毒性試驗(yàn)對(duì)了解新藥的毒性是非常必要的。 急性毒性試驗(yàn)的目的是推測(cè)新藥對(duì)人的急性毒性的強(qiáng)弱。急性毒性試驗(yàn) 急性毒性試驗(yàn) (單次給藥毒性試驗(yàn) )主要觀察對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一次給藥后所產(chǎn)生的毒性癥狀及其程度，出現(xiàn)和消失的時(shí)間，死亡的發(fā)生率并計(jì)算出其最大給藥量，最小致死量、半數(shù)致死量 (LD50)等。由于中藥毒性常較小，單次給藥往往不能表現(xiàn)明顯的毒性作用，我國(guó)藥政部門把一日內(nèi)多次給藥觀察受試藥物毒性的實(shí)驗(yàn)也稱作急性毒性實(shí)驗(yàn)。同時(shí)，它可以為長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)、生殖毒性試驗(yàn)、致突變?cè)囼?yàn)等試驗(yàn)設(shè)計(jì)提供劑量選擇依據(jù)和有關(guān)毒性信息，還可以推測(cè)受試藥物毒性發(fā)生的速度和持續(xù)時(shí)間，與半數(shù)有效量(ED50)比較判斷新藥的安全系數(shù)。 鑒于種種因素造成急性毒性試驗(yàn)結(jié)果 (癥狀和致死量 )在不同實(shí)驗(yàn)室內(nèi)有較大的差異，且耗費(fèi)大量動(dòng)物而所取得的動(dòng)物毒性的信息量相對(duì)較少，因此，各國(guó)目前都在修訂急性毒性試驗(yàn)的技術(shù)要求，希望能利用盡可能少的動(dòng)物數(shù)量而取得有價(jià)值的信息，同樣達(dá)到急性毒性試驗(yàn)的目的。為推測(cè)新藥對(duì)人的急性毒性，某些發(fā)達(dá)國(guó)家動(dòng)物急性毒性試驗(yàn)要求包含非嚙齒類動(dòng)物 (除家兔外 )在內(nèi)的兩種動(dòng)物，我國(guó)對(duì)此未作出明確規(guī)定。目前雖常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是小鼠或大鼠。 (二 )動(dòng)物的年齡、性別、體重 急性毒性受動(dòng)物的健康狀態(tài)、年齡、性別、遺傳因素、體重、藥物的吸收、分布、代謝、排泄和內(nèi)分泌激素等的影響。而且，年幼動(dòng)物藥物代謝功能和敏感度較易發(fā)生變化，性別間的特性也尚未確立，因此，口服毒性通常使用年輕的性成熟的動(dòng)物， — 般小鼠 6— 8周齡，兩種性別，體重 1822g(同次試驗(yàn)體重相差不超過(guò) 2g)，大鼠 6— 8周齡，兩種性別，體重 120～ 150g(同次試驗(yàn)體重相差不超過(guò) 10g)。最小致死量或半數(shù)致死量，小動(dòng)物 (大鼠、小鼠 )試驗(yàn)組在三組以上，每組 — 般至少 10只動(dòng)物 (雌雄各半 )。大動(dòng)物 (犬、猴 )并不 — 定要求得到 LD50，可用少量動(dòng)物采用劑量遞增的方法觀察中毒癥狀，求近似致死量即可。 二、試驗(yàn)準(zhǔn)備 實(shí)驗(yàn)應(yīng)在符合 GLP的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)樣品質(zhì)量和穩(wěn)定性應(yīng)符合要求，與藥效學(xué)及臨床試驗(yàn)一致。也有用乙醇、聚乙醇等溶劑配成樣品液者，但溶劑本身的急性毒性能干擾試驗(yàn)結(jié)果，因此，急性毒性試驗(yàn)報(bào)告中應(yīng)對(duì)樣品液的配制方法加以詳細(xì)說(shuō)明，必要時(shí)設(shè)溶劑對(duì)照組。不同劑量的設(shè)定有兩種方式， — 是濃度一定不同給藥容量，另 — 種是容量一定不同給藥濃度，兩者各有所長(zhǎng)。因此，通常采用同容量不同濃度的給藥方法，注射給藥藥液濃度應(yīng)勺體液濃度等滲 (至少不應(yīng)低滲 )，口服液不必作特殊考慮，對(duì)毒性低的中藥制劑而言，應(yīng)以能保持一定流動(dòng)性的最大濃度作為口服樣品液。 (二 )給藥途徑 中藥新藥除臨床給藥途徑外， — 、二類新藥還希望其他給藥途徑，水溶性藥 物應(yīng)同時(shí)采用靜脈給藥途徑，其他如油劑，混懸劑之類可采用皮下給藥途徑。 各給藥途徑的容量一般為小鼠 0． 4— 0． 5ml／ 20g(體重 )，大鼠 lml／l00g(體重 )。大鼠口服最大容量不超過(guò) 2ml／ l00g(體重 )，其他途徑不超過(guò) lml／ l00g(體重 )。發(fā)現(xiàn)毒性癥狀及毒性反應(yīng)的靶器官同樣是急毒實(shí)驗(yàn)非常重要的目的。以后 1日至少觀察 1次，觀察 7 日觀察癥狀包括①行動(dòng)：不安定、多動(dòng)、發(fā)聲；②神經(jīng)系統(tǒng)反應(yīng)：舉尾、振顫、痙攣、運(yùn)動(dòng)失調(diào)、姿態(tài)異常；③自主神經(jīng)系統(tǒng)反應(yīng)：眼球突出、流涎、流汨、排尿、下瀉、豎毛、皮膚變色、呼吸；④死亡。試驗(yàn)結(jié)束存活動(dòng)物也進(jìn)行解剖，如有病變進(jìn)行組織學(xué)觀察。Bliss法嚴(yán)謹(jǐn)精確，缺點(diǎn)是計(jì)算非常繁復(fù)。各種方法原則基本相同，如：①劑量劉數(shù)值應(yīng)為等差，即劑量應(yīng)按等比級(jí)數(shù)排列；②各組動(dòng)物數(shù)應(yīng)相等；③死亡率應(yīng)在 50％上下基本對(duì)稱分布等。如受試物毒性低，測(cè)不出 LD50，可求得最大給藥量。半數(shù)致死量測(cè)定方法很多，但實(shí)驗(yàn)沒計(jì)大同小異，所不同者為算方法的不同，其試驗(yàn)方法如下： 預(yù)試驗(yàn)：目的是找出 0％及 100％估計(jì)致死量。可用雌或雄性動(dòng)物，設(shè)四組以上，每組 34只，先用 1； 10的劑量比給藥 (如 5mg／ kg、50mg／ kg、 500mg／ kg、 5000mg／ kg固定劑量 )。然后在死亡數(shù) 4／ 4和 0／ 4兩組之間按